质粒DNA制备说课讲解.pptVIP

四、质粒DNA的提取和纯化 （一）、质粒提取的主要步骤 1．细菌的培养： 先分离单个菌落， 接种到含少量适当抗生素的培养基中扩增，随着细菌的生长，质粒DNA也在自主复制。 对于松弛型质粒，由于它的复制在一定程度上受到宿主细胞的控制，故在细菌对数生长后期，加入氯霉素抑制宿主蛋白质的合成和染色体DNA的复制。质粒DNA的复制不受影响而大量扩增。 对于新一代的质粒如pUC系列等，由于宿主对这些松弛型质粒的复制控制不严，利用氯霉素对质粒DNA的选择性扩增并不十分必要。 长时间在氯霉素存在下，质粒DNA合成过程中，复制链中会掺入核糖核苷酸，对碱性条件敏感，将会导致大量的缺口环状DNA和线性质粒的产生． 但有些人仍然偏爱用氯霉素选择性扩增质粒，其理由是在中等体积培养物中能获取与大量培养物等同的质粒产量。而且细菌量的减少，使得裂解物的复杂性和粘稠度降低，操作更方便、有效，对煮沸法更是如此。所以使用氯霉素的主要目的，是在不减低质粒产量的前提下，减少细菌的培养体积和细菌的数量． 有时质粒在细菌中的扩增状况很差，常是由于质粒携带外源基因或质粒分子量过大所致。 这种低效率扩增，可利用高营养培养基促进生长，一般可增加质粒产量4-6倍。 2．细菌的收集与裂解 细胞生长过程中，排出大量代谢产物，为了提高质粒DNA的纯度，离心弃上清，细菌沉淀最好用STE或生理盐水悬浮，漂洗l-2次，离心管