《PCR技术及应用》-公开课件.pptVIP

三篇重要论文 The Unusual Origin of the Polymerase Chain (Scientific American, 1990,262(4):56--61,64--65) Primer--directed Enzymatic Amplification of DNA with directed a Thermostable DNA Polymerase (Science, 1988, 239(4839): 487--91) Specific Synthesis of DNA In Vitro via a Polymerase Catalyzed Chain Reaction (Methods in Enzymology, 1987, 155:335--50) （4）Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus) 1.0-2.5 U/50 ?l 酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。 经典循环参数（500bp以内） PCR技术质量控制 实验室的规范化设置 试剂贮存区和准备区 标本制备区 扩增反应区 产物分析区 PCR技术质量控制 PCR技术的质量保证 产物污染 试剂污染 标本间的交叉污染 以PCR为基础的相关技术 反转录PCR 巢式PCR 定量PCR 多重PCR PCR诱导定点突变 原位PCR 差异显示PCR 其他扩增技术 荧光定量PCR DNA结合染料技术 SYBR Green I 水解探针技术 Taqman 杂交探针技术 Dual Probes(FRET) 分子信标技术 Molecular Beacons 连接酶链反应 RAPD NASBA RFLP SSCP 变性梯度凝胶电泳 不同序列的DNA分子具有不同的融点温度，单碱基替代可引起1.5℃的差异。 DNA片段在变性剂梯度聚丙烯酰胺凝胶中电泳，凝 胶中自上而下所含变性剂浓度呈线性增加。DNA片段在进入变性剂某一浓度时，此浓 度下DNA片段在最低温度解链区域解链(相当于该区域的Tm值)，此时DNA分子成分枝状 结构，它使DNA分子在胶中的移动减慢。如果梯度条件选择恰当，因单个碱基变化使 不同的DNA片段在凝胶中的不同位置分叉，随后DNA片段移动减慢，从而使笪DNA片段 最终分离开来。 融点曲线分析 野生型序列和突变序列的Tm值不同，则融点曲线不同 如果用荧光染料染色，DNA在复性时结合荧光最强，随着温度上升荧光逐渐降低，温度升至融点温度时荧光急剧下降 PCR产物序列分析 直接测序 克隆测序 5’ 3’ 5’ 3’ SG SG SG SG SG Excitation Emission SYBR-Green I R Q 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ Excitation R Q Q R Q R Excitation 双标记探针（Taqman Probe） Oligo 1: Fluorescein Oligo 2: LC Red 640 Excitation Emission Transfer 荧光共振能量传递（FRET Probe） R Q Excitation R Q Q R Excitation Emission 分子信标（Molecular Beacon Probe） 荧光定量实时PCR与普通PCR的比较 实时在线监控 对样品扩增的整个过程进行实时监控,能够实时地观察到产物的增加,直观地看到反应的对数期 降低反应的非特异性 使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合,提高了PCR反应的特异性 增加定量的精确性 全程监控,准确的算法进行定量 结果分析更加快捷方便,无需跑胶 DMD：人类肌营养不良基因 A：无外显子8,12,17,19对应条带,说明病人外显子8～19缺失 B：病人B中未扩增外显子带的强度为C的一半,提示为区域缺失携带者 C：正常人DMD基因外显子的一般扩增形式 多重PCR检测DMD基因缺失 原位ＰＣＲ 原位聚合酶链式反应（In Still PCR,Is－PCR）是由Haase等于1990年首创。它是利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段,在不破坏细胞的前提下,利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。 直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行ＰＣＲ扩增。可进行细胞内定位。 适用于检测病理切片中含量较少的靶序列 原位PCR的作用 既往鉴定细胞内特异序列一般采用原位杂交（ISH）,但在每个细胞中