人纤溶酶原kringle区缺失突变体的毕赤酵母表达、产物纯化及鉴定.docVIP

广东药学院学报 ＪｏｕｒｎａｌｏｆＧｕａｎｇｄｏｎｇＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅＪｕｎ．２００９．２５（３） 人纤溶酶原ｋｒｉｎｇｌｅ区缺失突变体的毕赤酵母表达、产物纯化及鉴定 陈武１，莫炜２，张艳玲２，宋钢２，宋后燕２ （１．广东药学院生命科学与生物制药学院，广东广州５１０００６；２．复旦大学分子医学教育部重点实验室，上海２１００３２） 摘要：目的研究人纤溶酶原ｋｆｉｎ＃ｅ区缺失突变体（ＰＬＧＡＫ）的毕赤酵母（Ｐ＆ｈｍｐａｓｔｏｒｉｓ）表达、产物纯化及理化性质鉴定。方法采用７．５Ｌ发酵罐对工程菌ＰＬＧＡＫ／ＧＳｌ１５进行高密度培养、甲醇诱导表达，培液经离心、超滤、离子交换层析、凝胶滤过、透析后冷冻干燥。等电聚焦电泳、ＨＰＬＣ、质谱分别检测ＰＬＧＡＫ等电点、纯度和分子量；纤维蛋白平板、肽底物Ｓ－２４０３分别测定ＰＬＧＡＫ激活后的纤维蛋白和酰胺水解活性。结果７．５Ｌ高密度发酵叮获得约为４００ｍｇ／Ｌ培液的表达量，经三步纯化后制备的ＰＬＧＡＫ纯度大于９６％。理化分析显示ＰＬＧＡＫ的等电点为７．５—７．８，分子量：２７．７８７ｋＤ，比活性：２３．６Ｕ／ｍｇ。结论初步建立了ＰＬＧＡＫ的酵母高密度发酵及纯化工艺，所制备半成品活性与血浆提取的ＰＬＧ相近，具备放大生产和应用的潜力。 关键词：毕赤酵母；ｋｆｉｎ—ｅ区；纤溶酶原；缺失突变体；纯化 中图分类号：ＴＱ９２文献标识码：Ａ文章编号：１００６—８７８３（２００９）０３—０２９９一０５ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｋｒｉｎｇｌｅｄｏｍａｉｎｄｅｌｅｔｉｏｎｍｕｔａｎｔｏｆ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎｉｎＰ／ｃｈ／ａｐａｓｔｏｒ／ｓ ＣＨＥＮＷｕｌ，ＭＯＷｅｉ２，ＺＨＡＮＧＹａｎ—ｌｉｎ２，ＳＯＮＧＧａｎ９２，ＳＯＮＧＨｏｕ—ｙａｎ２ （１．ＳｃｈｏｏｌｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓａｎｄＢｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，ＧｕａｎｇｄｏｎｇＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ５１０００６；２．ＴｈｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｅｄ＆ｉｎｅ，Ｍｉｎ矗ｔｒｙｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎ，ＳｈａｎｇｈａｉＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅ，ＦｕｄａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ２０００３２，Ｃｈｉｎａ） Ｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｓｏｆｔｈｅｋｒｉｎｇｌｅｄｏｍａｉｎ ｄｅｌｅｔｉｏｎｍｕｔａｎｔｏｆｈｕｍａｎｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ（ＰＬＧＡＫ）ｉｎＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ．ＭｅｔｈｏｄｓＦｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎａｔｈｉｉｓｈｄｅｎｓｉｔｙ（Ａ６００＞２００）ｉｎａ７．５ＬｆｅｒｍｅｎｔｅｒｗａｇｃａｒｒｉｅｄｏｕｔａｎｄＰＬＧＡＫｗａｓｐｕｒｉｆｉｅｄｆｒｏｍｔｈｅｃｕｌｔｕｒｅｂｍｔｈｉｎａ ｓｔｅｐ—ｐｒｏｃｅｓｓ：ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ，ｇｅｌｆｉｈｒａｔｉｏｎ，ｉｏｎｅｘｃｈａｎｇｅｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ａｎｄＷａｓｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄａｆｔｅｒ ＩＦＥ，ＨＰＬＣａｎｄＬＣ—ＭＳｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔｉｔｓｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃｐｏｉｎｔ（ＩＰ），ｐｕｒｉｔｙ，ａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｅａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄａｍｉｄｏｌｙｔｉｃａｃｔｉｖｉｔｙｗｅｒｅｍｅａｓｕｒｅｄｗｉｔｈｆｉｂｒｉｎｐｌａｔｅａｎｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓｕｂｓｔｒａｔｅＳ－２４０３ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＲｅｓｕｌｔｓＦｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｉｎ７．５Ｌｓｃａｌｅｙｉｅｌｄｅｄ８／１ ｌｅｖｅｌｏｆａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ４００ｎａｇＰＬＧ△Ｋｐｅｒｌｉｔｅｒｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｂｒｏｔｈ．Ｔｈｒｏｕｇｈｔｈｒｅｅｓｔｅｐｓｏｆ ＰＬＧＡＫｈａｄａｐｕｒｉｔｙｏｆｏｖｅｒ９６％．ＴｈｅｅｘａｃｔＭＷｏｆＰＬＧＡＫＷａｓ２７．７８７ｋＤｅｘａｍｉｎｅｄｂｙ ａｎｄｉｔｓＩＰＷ８８７．５－７．８．ＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎＡｐｉｌｏｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｏｆＰＬＧＡＫｉｎｐａｓｔｏｒｉｓｃｕｌｔｕｒｅｄａｔｈｉｓｈｄｅｎｓｉｔｙｈａｓｂｅｅｎｓｅｔｕｐ．Ｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｒｅ ｔｏｔｈａｔｏｆｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎｅｘｔｒａｃｔｅｄｆｒｏｍｈｕｍａｎｐｌａｓｍａ，ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇａｇｏｏｄｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｉｎｓｃａｌｅｕｐａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ． ｗｏｒｄｓ：ｄｅｌｅｔｉｏｎｍｕｔａｎｔ；ｋｒｉｎｇｌｅｄｏｍａｉｎ；Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ；ｐｌ