动物病毒学-实验二 原代细胞培养.ppt

实验二 原代细胞培养 （以鸡胚成纤维细胞为例） 成纤维细胞（fibroblast）是疏松结缔组织的主要细胞成分。 结缔组织又分为疏松结缔组织（如皮下组织）、致密结缔组织（如腱）、脂肪组织等。 疏松结缔组织由少量多种细胞和大量细胞间质组成。细胞包括成纤维细胞、浆细胞、巨噬细胞、肥大细胞等。其中成纤维细胞数目最多。 一、实验目的 了解不同原代细胞的形态，掌握鸡胚成纤维细胞的制备与培养方法。 A B A 上皮细胞 B 成纤维细胞 猪肺泡巨噬细胞 原代细胞 继代细胞（二倍体细胞株） 传代细胞 根据细胞培养物的生物学特性不同分为: 动物细胞培养的类型 slides from CDC 倒置显微镜 A B A 上皮细胞 B 成纤维细胞 猪肺泡巨噬细胞 体外培养的细胞按其形态可分为： 成纤维型细胞 上皮型细胞 游走型细胞 多形型细胞 C D A B Adenovirus(腺病毒) Uninfected epithelial cells early infection B. late infection slides from CDC Respiratory syncytial virus 呼吸道合胞病毒 Herpes simplex virus单纯疱疹病毒 Uninfected fibroblastic cells A. early infection B. late infection slides from CDC Poliovirus 脊髓灰质炎病毒 A A B B 二、原代细胞制备的原理 应用胰酶等分散剂将动物组织消化成单个细胞悬液，适当洗涤以后，加入营养液，通常可使其贴附于玻璃瓶壁上，并生长增殖。 三、材料1. 9-12日龄鸡胚2. 照蛋灯与蛋座3. 碘酊棉球与酒精棉球4. 眼科剪、小镊子5. 平皿、细菌瓶、吸管、吸球、细胞瓶 6. 0.25%胰酶7. 基础培养液：DMEM或者生理盐水 生长液：含10%犊牛血清、200U/ml青霉素、200μg/ml链霉素的DMEM 使精氨酸或赖氨酸的羧基和其他氨基酸的氨基之间的多肽链发生水解，导致细胞间质水解而使细胞或组织块消化为分散的单个细胞。 四、胰酶的作用机制 五、血清 1. 血清的作用 提供细胞生存、生长和增生所必须的生长调节因子 补充基础培养液中没有或量不足的营养成分 促进细胞贴壁 提供载体蛋白，可结合维生素、脂质、金属离子等 中和毒性物质 良好的缓冲系统 提供蛋白酶抑制剂 2. 血清的种类 胎牛血清、新生犊牛血清、成年牛血清、马血清、鸡血清、兔血清、羊血清、人血清3. 血清的处理 无菌采集，过滤除菌。用前56℃灭活30min。 六、细胞培养的条件要求1）细胞密度原代细胞：4-6×105个/ml传代细胞：2-3×105个/ml2）pH范围：最适pH7.0-7.4，耐受pH6.6-7.83）培养温度 七、操作步骤 取9-12日龄孵育良好的鸡胚，依次用碘酊和酒精消毒气室部。 无菌操作下用剪子去除气室部卵壳和壳膜，穿破绒毛尿囊膜，夹住鸡胚颈部，取出鸡胚放于灭菌平皿中。 用眼科剪、镊去除鸡胚头、四肢及内脏（内脏颜色偏深）。在平皿的一角加入2ml左右生理盐水冲冼鸡胚，同样方法重复一次。 将冲洗后的鸡胚移入新的平皿中，在边角处用剪子充分剪碎，使其近于乳糜状(至少10min以上）（不能将胚体放在生理盐水中，否则很难剪碎） 将剪碎的组织块倒入细菌瓶中，加入5ml生理盐水，振摇几次，静置2-3分钟，吸弃洗液。如此重复1次。 加5mL预热的胰酶，在37℃水浴中消化20-30min，每隔5min轻轻摇动1次，使细胞消化完全（组织块变松散，沉降渐变缓慢时即表示消化足够）。 消化好后，取出瓶子，静置约2-3分钟，吸弃胰蛋白酶液。 加DMEM生长液5ml，轻轻摇动几次后，静置2-3分钟吸去。如此重复一次。 加入生长液5ml，以粗口吸管吹吸数次，使细胞脱落分散，静置2-3分钟，使未消化好的组织块下沉（沉降时间不要过长）。 轻轻吸取上层细胞悬液于细胞培养瓶中，每瓶约0.5-1ml（根据鸡胚大小和消化程度确定），补加DMEM生长液至6ml，使细胞量约为4-6×105个/ml，盖上盖子，置于37℃恒温箱中培养。 细胞计数方法 取细胞悬液0.5ml+2ml 0.1%结晶紫—枸椽酸（0.1mol/L）溶液，室温或37℃温箱中5-10min，充分振荡后进行计数。 按白细胞计数法计算4角4个大方格内的细胞总数（N）。 每ml悬液中的细胞数（n）=N/4×10000×K（稀释倍数）。   血细胞计数板 ○表示可计数 ●表示不计数 八、实验思考题 吸管的使用。 胰酶用于细胞消化的原理是什么? 鸡