动物病毒学-第八章 病毒病的实验室诊.ppt

* 分子技术更有利于病毒抗原的诊断和检测。组织培养中抗原的纯化是很困难的，尤其一些病毒培养十分困难，这些是人们获得抗原更加困难。对病毒基因进行克隆和表达，可以简化病毒纯化和病毒的大规模培养。Nucleic acid detection and amplication Hybridization * Digest with size-specific restriction endonucleases(限制性内切酶多型性RFLP analysis: the assay of restriction fragment length polymorphisms) 尽管RNA病毒可以通过cDNA来检测，但大多用于DNA病毒的检测。RFLP方法用于多种病毒株的分型，也是最便利的用于病毒分型的方法convenient discriminating。但临床上常用敏感性(sensitivity)更好的方法，如分子杂交、核酸扩增。 * * * * * * Enhancements of PCR * * 多重PCR * * Fixed, protease-digested cells are diffused with PCR reaction mixture, PCR product does not diffuse Loation of template within cells is shown Complex sample preparation and reaction conditions increased cost * 原位杂交 多用于细胞内病毒的检测和定位。 将细胞或组织切片固定于载玻片上，保持细胞的良好形态结构，经蛋白酶K处理以增加细胞膜和核膜的通透性，探针在合适条件下与细胞内的病毒核酸杂交。 核酸扩增（Nucleic acid amplication） 在特异性引物、四种脱氧核糖核苷酸（dNTPs)、核酸聚合酶催化下，以病毒核酸为模板由5’到3’扩增延长，每经过变性、复性、延伸一个循环，模板核酸量增加1倍 新合成核酸又作为下一轮循环的模板，经过多个循环，可使样品中核酸量增加109--1011倍 The polymerase chain reaction(PCR) Reverse transcriptase (RT) PCR Multiplex PCR Nested PCR In situ PCR Real-Time PCR reverse transcriptase PCR PCR前增加了从RNA到cDNA的逆转录过程 用于检测RNA病毒 Multiplex PCR 用于多型病毒的分型检测或同时检测几种病毒 使用数对不同引物，为了检测方便，目的产物大小要有一定差别。 nested PCR 由两对引物经两组循环完成 第一对引物(外引物)扩增出一条较长的产物；第二对引物以此为模板经二次循环扩增目的产物 敏感、特异性较PCR更高 In situ PCR 经固定、蛋白酶K消化的细胞，直接进行PCR反应 可用于病毒在细胞和组织内的定位检测 样品处理和准备较复杂，费用较高 Real-Time PCR 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法 高通量检测方法 生物芯片（biochip） 是指采用光导原位合成或微量点样等方法，将大量生物大分子比如核酸片段、多肽分子甚至组织切片、细胞等等生物样品有序地固化于支持物（如玻片、硅片等载体）的表面，组成密集二维分子排列，然后与已标记的待测生物样品中靶分子杂交，通过特定的仪器比如激光共聚焦扫描或电荷偶联摄影像机（CCD）对杂交信号的强度进行快速、并行、高效地检测分析，从而判断样品中靶分子的数量。 生物芯片种类 基因芯片 蛋白质芯片 组织芯片 细胞芯片 生物芯片在近几年发展极为迅速，但它也面临着巨大的挑战，主要体现在以下几个方面。(1)所需费用较高。(2)自动化程度不高。目前生物芯片技术对操作人员仍要求较高，每个实验室都需要一个专门的技术人员去建立并操作。(3)目前，对于实验的许多结果还不能做出完美的解释。这将依赖于生物学的整体发展，这也促进了人们对生物学进行更深层次的研究。(4)对结果的扫描、去除背景、数据处理等，目前还不能作得很完美。 PFU、TCID50 、 LD50、ID50各代表什么？ 疾病诊断时，处理的病料接种敏感细胞后，可以从哪几个方面来判定细胞中是否有病毒增殖？ 若送来一份病料要进行疑似病原检测，请你设计一个实验将该工作完成。 常用的免疫学诊断方法有哪些？ 什么是噬斑？其原理是什么？ 6. 标记疫苗与配套诊断试剂的联合应用在传染病的根除中具有非常重要的意义，说明其原理。 思 考 题