讲义—血红蛋白的提取与分离模板.pptxVIP

课 题 3血红蛋白的提取和分离;课题背景;基础知识;1、分离生物大分子的基本思路;3、高温灭菌和酒精灭菌分别利用蛋白质的何种作用，作用结果是什么被破坏？;（三） 凝胶色谱法;②实例：葡聚糖、琼脂糖;①大多数凝胶是由多糖类化合物（如葡聚糖或琼脂糖）构成的多孔小球体，内部有许多贯穿的通道;例1 利用凝胶色谱法，什么样的蛋白质先洗脱出来 A.相对分子质量大的 B.溶解度高的 C.相对分子量小的 D.所代电荷多的;2. 凝胶色谱法分离蛋白质的依据是 A. 对其他分子的亲和力 B. 溶解度 C. 所带电荷多少 D. 相对分子质量的大小 ;（四）缓冲溶液;3、缓冲溶液的配制;②弱碱和弱碱盐;思考：在血红蛋白整个实验室中用的缓冲液是什么？它的目的是什么？;（五）电泳：;②电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离;3、类型; 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带静电荷的多少以及分子的大小等因素;SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是单条肽链的分子量。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种电荷间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。;讨论：如何测定蛋白质的分子量？;例题1：（2005深圳一模）细菌蛋白质在极端环境条件下可通过肽链之间的二硫键维持稳定。已知不同的多肽产物可因分子量不同而以电泳方式分离。下列左图是一个分析细菌蛋白的电脉结果图， “-”代表没加还原剂，“+”代表加有还原剂，还原剂可打断二硫键，“M”代表已知分子量的蛋白质。右侧数字代表蛋白质或多肽的相对分子量。根据左侧结果，右列哪个图案最能代表该细菌原本的多肽结构？(注意：“—”代表二硫键) ;b;例2 在电场作用下，带电分子会如何移动？ 这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。 ;二、实验操作;血液; 每个肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳，血红蛋白因含有血红素而呈红色;(2)红细胞的洗涤;C、吸取血浆：上层透明的黄色血浆;(3)血红蛋白的释放;第1层（最上层）：甲苯层（无色透明）; 用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体;4. 分离血红蛋白溶液时，将混合液离心后可看到试管中的液体分为4层：第一层为 ，第二层为 固体，第三层为 的沉淀层，第三层是 液体，是 的水溶液，第四层是其他杂质的 沉淀物。 ;5.红细胞含有大量的血红蛋白，红细胞的机能主要是由血红蛋白完成，血红蛋白的主要功能是携带氧气或二氧化碳，我们可以选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液进行实验，来提取和分离血红蛋白，请回答下列有关问题： （1）血红蛋白提取和分离的程度可分为四步：______、______、______和______。 ; 取1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/l的磷酸缓冲液中（pH为7.0），透析12小时;2、凝胶色谱;底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底;（2）凝胶色谱柱的装填;配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液;注意：;1、液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果;（3）样品加入与洗脱;③样品渗入凝胶床;讨论：;2、与其他真核细胞相比，红细胞有什么特点？这一特点对你进行蛋白质得分离有什么意义？;血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即样品的粗分离；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量较大杂质蛋白除去，即样品的纯化；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定;洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液;观察你处理的血液样品离心后是否分层（见教科书图5-18），如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。;由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝