11DNA重组技术的工具2.ppt

G 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ A 磷酸二酯键 3’端 5’端 3’端 5’端 磷酸二酯键 3’ 5’ 限制酶的识别序列 一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列 在G与A之间切割 大肠杆菌的一种限制酶(EcoRⅠ)只能识别GAATTC 序列，并在G和A之间切开。 例1：EcoRI限制酶 　 黏性末端　　　　 黏性末端 被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。 EcoRI限制酶的切割 SmaI限制酶只能识别CCCGGG序列，并在C和G之 间切开。 例2：SmaI限制酶 在G与C之间切割 平末端　　　平末端 当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。 SmaI限制酶的切割 CTTCATG AATTCCCTAA GAAGTACTTAA GGGATT GGCATCTTAA AATTCCGTAG CTTCATG AATTCCCTAA GAAGTACTTAA GGGATT GGCATCTTAA AATTCCGTAG 目的基因 为什么限制酶主要是在原核生物中提取的？你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是是什么吗？ 要想获得某个特定性状的目的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性(平)末端？ 要切两个切口，产生四个黏性(平)末端。 如果把两种来源不同的DNA用同种限制酶来切割，会怎样？ 会产生相同的黏性(平)末端 如果把具有相同黏性(平)末端的DNA连接起来，又会怎样呢？ 得到重组DNA 项目 内容 种类 (比较) 作用 对象 原理 结果 E.coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶 只作用于 末端 主要作用于 末端，还可作用于 末端 DNA片段 形成磷酸二酯键 黏性 平 黏性 通过形成新的磷酸二酯键，而将两条DNA 的“扶手缝隙”连接起来，形成重组DNA 一、基因工程的基本工具 2、分子缝合针——DNA连接酶 把切下来的DNA片段拼接成新的DNA，即将脱氧核糖和磷酸连接起来催化形成磷酸二酯键 DNA连接酶的作用 两DNA片段要具有互补的黏性末端才能拼起来 DNA连接酶的缝合作用 可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来， 注意：DNA连接酶可连接双链DNA中的DNA单链缺口，但不能连接单链DNA！ DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？ T4 DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率较低 DNA连接酶的缝合作用 比较 DNA连接酶 DNA聚合酶 不 同 点 连接的DNA 链 链 模板 连接的对象 相同点 作用实质 形成 键 单 双 不要 要 2个DNA片段 单个脱氧核苷酸加到已存在的单链DNA片段上 磷酸二酯 限制性内切酶Ⅰ的识别序列和切点是—G↓GATCC—，限制性内切酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—。在质粒上有酶Ⅰ的一个切点，在目的基因的两侧各有一个酶Ⅱ的切点。 （1）请画出质粒被限制酶Ⅰ切割后所形成的黏性末端。 （2）请画出目的基因两侧被限制酶Ⅱ切割后所形成的黏性末端。 （3）在DNA连接酶作用下，上述两种不同限制酶切割后形成的黏性末端能否连接？为什么？ 可以连接。因为由两种不同限制酶切割后形成的黏性末端是相同的（或是可以互补的） 小试身手 DNA1 CTTCATG AATTCCCTAA GAAGTACTTAA GGGATT DNA2 GGCATCTTAA AATTCCGTAG 重组DNA GGCATCTTAA AATTCCGTAG 由于切割后的载体和目的基因具有相同的末端，故重组DNA存在3中可能连接。即 、 、 。 重组DNA一定是载体-目的基因连接吗？ 载体-目的基因 载体-载体 目的基因-目的基因 载体的作用 载体的必要条件 载体的种类 阅读课本第6页“分子运输车”——运载体的相关内容，填写下表 自主学习 1）能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。 2）具多个限制酶切点，以便与外源基因连接。 3）具有某些标记基因，便于进行鉴定和选择。 4）必须是安全的 ，对受体细胞无害。 5