实验八 PCR产品纯化及定向克隆-09级.pptVIP

实验八 PCR产品纯化及定向克隆 一、实验目的 学习并掌握基因工程操作技术中最常用的DNA纯化和连接方法；巩固DNA酶切的操作。 二、实验原理 PCR产物一般都含有过量的引物、Taq酶及dNTP等成分，直接影响后续的基因操作，利用苯酚/氯仿、氯仿依次抽提反应体系中的酶，然后在酸性条件下用乙醇沉淀DNA。 根据实验六所用的PCR引物，其产品的5′和3′末端分别具有EcoR I和Not I酶切位点，而载体pET32的多克隆位点中也有此两个酶切位点。因此，若将PCR产物与载体分别用EcoR I和Not I进行双酶切，所得的产物相应末端正好互补，可用T4 DNA连接酶在体外进行连接。 三、实验材料与主要试剂 1、实验材料 实验二提取的质粒载体pET32 实验七的PCR产品以及实验八的RT-PCR产品 2、主要试剂 限制性核酸内切酶：EcoR I和Not I T4 DNA连接酶 苯酚/氯仿/异戊醇、氯仿、醋酸钠（pH5.2）、 无水乙醇、70%乙醇等 四、实验步骤 1、PCR产品的纯化 每组同学的PCR和RT-PCR产品合并，约130μl，转入1.5ml离心管中，向PCR产品中加入150μl苯酚/氯仿/异戊醇，旋涡混合，14000 rpm离心5