腺相关病毒操作手册--汉恒生物.pdf

汉恒生物‐‐‐腺相关病毒  汉恒生物腺相关病毒操作手册 一、腺相关病毒（Adeno-Associated Viral Vector ，AAV ）简介 腺相关病毒属微小病毒科( parvovirus)，为无包膜的单链线状 DNA 病毒。AAV 的基因组约 4700bp ，包括上下游两个开放读码框架(ORF)，位于分别由 145 个核苷 酸组成的 2 个反向末端重复序列(ITR)之间。 基因组中有 3 个启动子(P5 、P19 和 P40) 和 2 个开放阅读读框(ORF) ，rep 和 cap，如图 1 所示。rep 编码 4 个重叠的多功能蛋白，即 Rep78 、Rep68 、Rep52 和 Rep40 ，其中 Rep78 与 Rep68 参与 AAV 的复制与整合，Rep52 和 Rep40 具有解螺旋 酶和 ATP 酶活性，与 Rep78 、Rep68 共同参与单链基因组的复制；cap 编码的 VP1 、 VP2 、VP3是装配成完整病毒所需要的衣壳蛋白，它们在 AAV 病毒整合、复制和装 配中其重要作用。 图1. AAV 基因组结构 二、腺相关病毒的优点 1. 安全性高：迄今从未发现野生型 AAV 对人体致病，重组 AAV 基因组序列上去 除了大部分的野生型 AAV 基因组元件，进一步保证了安全性； 2. 免疫原性低：AAV2 的基因组仅 4681 个核苷酸，便于用常规的重组 DNA技术 进行操作，而且进行动物实验时造成的免疫反应小； 3. 宿主范围广：能感染分裂细胞和非分裂细胞； 4. 表达稳定：能介导基因的长期稳定表达； 5. 物理性质稳定：在 60 ℃不能被灭活，能抗氯仿； 三、重组腺相关病毒载体系统简介 1   汉恒生物科技(上海)有限公司                                                                                                                400‐092‐0065    地址：上海市徐汇区斜土路 1175 号景泰大厦 1503                                                                        021 实验室：上海市张江高科技园区张江药谷孵化器 1 号楼 314                                                      汉恒生物科技  邮箱：service@ 汉恒生物‐‐‐腺相关病毒  AAV 是一种复制缺陷型微小病毒，其增殖复制需要腺病毒或疱疹病毒的辅助。 AAV无辅助病毒系统（AAV Helper-Free System ）可以在无辅助病毒的条件下生产出 重组腺相关病毒。在AAV Helper-Free System 中，生产具有感染性的AAV 病毒颗粒所 需的腺病毒基因产物（如：E2A ，E4 等基因）大部分由pHelper 质粒提供，其余的腺 病毒基因产物由稳定表达腺病毒E1基因的AAV-293宿主细胞提供。AAV-293细胞是 HEK293细胞经过改良腺相关病毒生产能力而衍生出的亚克隆细胞系。野生型AAV 基 因组由病毒rep 和cap 基因（分别编码AAV复制和包装相关的基因）及位于两侧的表 达和包装必须的顺式作用元件——反向末端重复序列（Inverted Terminal Repeats ， ITRs ）组成。在AAV Helper-Free System 中，rep 和cap 基因从病毒载体中被转移到辅 助质粒pAAV-RC 中，AAV ITRs 仍位于病毒载体中。在辅助质粒的帮助下，仅需两端 的ITR 就能将携带的外源片段包装进入腺相关病毒颗粒，因此，rep 和cap 基因的转移 后空出的位置是允许外源基因插入病毒基因组中的最大限度。由于不再需要活的辅助 病毒，AAV Helper-Free System 提供一个更安全，更便利的替代逆转录病毒和腺病毒 的基因传递系统。