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禽流感实验室检测方法 一、标本的采集与处理 (一)标本的采集 1、病毒分离标本的采集 病毒分离成功与否很大程度上取决于采集标本的质量，及其保存、运输等环节。多数标本取自患者上呼吸道鼻咽腔，其次为气管和支气管分泌物，有时也采用肺活检材料等。 标本采集后应立即放入适当的采样液中低温保存，常用的采样液为：普通肉汤，pH7.4-7.6的Hank's、Eagle's或水解乳蛋白液。为防止细菌和真菌生长，在采样液中需加入抗菌素，以往抗菌素多用青、链霉素，近来发现不少种类细菌对它们具有耐药性，故近来多用庆大霉素（其终浓度为每ml采样液中加入0.1 ml的10mg/ml）和抗真菌药物（终浓度为每毫升采样液中加入0.008 ml的250ug/ ml）。主要的采集方法有以下几种： 1)鼻拭子：将棉签轻轻插入鼻道内鼻腭处，停留片刻后缓慢转动退出。以同一拭子拭两侧鼻孔。将棉签浸入4-5 ml采样液中，尾部弃去。 2)咽拭子：用棉签擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，同样将棉签头浸入4-5 ml采样液中，尾部弃去。注：亦可将鼻、咽拭子收集于同一采样管中，以便提高分离率，减少工作量。 3)鼻咽抽取物：用与负压泵相连的收集器（国外有售）从鼻咽部抽取粘液。先将收集器头部插入鼻腔，接通负压，旋转收集器头部并缓慢退出。收集抽取的粘液，并用采样液涮洗收集器3次。由于该收集器国内难买到，也可采用国内一种设计装置（见郭元吉、程小雯著，流行性感冒病毒及其实验技术。中国三峡出版社P186，1997）。 4)鼻洗液：患者取坐姿，头微后仰，用移液管将1-1.5ml洗液注入一侧鼻孔，嘱患者同时发K音以关闭咽腔。然后让患者低头使洗液流出，用平皿或烧杯收集洗液。重复此过程数次。洗两侧鼻孔最多可用10-15 ml洗液。 5)漱口液：用10 ml洗液漱口。漱时让患者头部微后仰，发“噢声”，让洗液在咽部转动。然后，用平皿或烧杯收集洗液。 注：取鼻洗液和漱口液时，需预先了解患者是否对抗菌素有过敏史，如有则洗液和含漱液中不应含有抗菌素。 2、血清标本采集 血清标本应包括急性期和恢复期双份血清。急性期血样应尽早采集，最迟不超过发病后7天。恢复期血样应在发病后2-4周采集。单份血清一般不能用作诊断。血液标本2000-2500rpm离心15min。收集血清，弃血凝块。 血清可在4℃存放一周，长期保存置-20℃。 (二)标本运送 标本应在低温下，24小时内运送至实验室。标本至实验室后，病毒分离标本应尽快进行接种分离，48h内能进行接种的可置于4℃保存，如未能接种应置-70℃或以下保存。 血清标本可在4℃存放一周，长期保存置-20℃或以下。 (三)标本处理 标本至实验室后，含棉拭子的标本，先将棉拭子在管壁反复挤压后取出。鼻腔或咽部洗液，用手将装标本的管充分振荡，将粘液打碎。置4℃待其自然沉淀5-10min，取上清5 ml。上清液可直接接种或低温保存。 鼻咽漱液或抽取液：用无菌毛细吸管，在无菌条件下反复吹打收集的溶液，以便打碎粘液，同样置4℃待其自然沉淀5-10min，取上清5 ml。上清液可直接接种或低温保存。 注：如采样液中尚未加抗菌素，应在接种前补加，用量同前，混匀后置4℃ 1-2h后方可接种。 二、病毒分离 病毒分离是流感诊断最常用和最可靠的方法之一。多用鸡胚来分离流感病毒。近来随着分子生物学技术的发展，发现通过鸡胚所分离到的流感病毒，其抗原性与原始标本的有所不同，而通过MDCK细胞分离出的，其抗原性与原始标本的相似。另外由于“O”相毒株的重现，MDCK等一些细胞对“O”相毒株的敏感性大大超出鸡胚的敏感性。因此，MDCK等一些细胞已成为流感病毒分离不可缺少的一种宿主系统。MDCK分离的病毒在很多国家尚未批准用于疫苗生产，因此在病毒分离时同时采用鸡胚和MDCK细胞两套系统。 流感病毒“O”相毒株不凝集鸡红细胞，故近来在流感病毒鉴定中常用豚鼠或人红细胞来代替。然而，该两种细胞无细胞核，沉积慢，一般在红细胞凝集及凝集抑制测定中需60分钟才能观察结果，同时在“U”型孔板中，很难沉积成像眼泪样的点即当中常有小空洞。 (一) MDCK细胞分离 1、实验材料 MDCK细胞 Eagle氏培养液 Hank's溶液 0.25%胰酶和Versene消化液 双抗（青、链霉素）或庆大霉素和抗真菌素 胎牛或小牛血清 5.6%或7.5%的NaHCO3 细胞培养液配制 每500 ml Eagle's 液加： 终浓度 双抗 5 ml 100U/ml青霉素