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Western Blot 实验操作指南 Western Blot 即蛋白质印迹法（免疫印迹试验），是分子生物学、生物化学和免疫遗 传学中常用的一种实验方法。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生 物组织样品中的特定蛋白进行显影。通过分析显影的位置和显影深度获得特定蛋白质在所 分析的细胞或组织中表达情况的信息。 实验流程 主要包括以下几个步骤： 样品制备；SDS凝胶电泳；转膜；封闭；免疫杂交；显影。 实验器材 操作步骤 样品制备 准备进行 western blot 的样品可分为细胞、组织、免疫沉淀或亲和纯化后的蛋白等。样品 为蛋白溶液时不需要进行提取，而样品为细胞、组织或包埋组织等则需要根据样品的特性 对其进行提取。根据需求不同还可针对于细胞亚结构进行提取。 （1）以体外培养的贴壁细胞样本为例，对其进行总蛋白提取： 1、 倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使 残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。 2、 每瓶细胞加 3ml 4℃预冷的 PBS（0.01M pH7.2～7.3）。平放轻轻摇动 1min 洗涤细 胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将 PBS 弃净后把培 养瓶置于冰上。 3、 按 1ml 裂解液加 10 μl PMSF（100mM），摇匀置于冰上。（PMSF 要摇匀至无结晶 时才可与裂解液混合。） 4、 每瓶细胞加 400 μl 含 PMSF 的裂解液，于冰上裂解 30min，为使细胞充分裂解培养 瓶要经常来回摇动。 5、 裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎 片和裂解液移至 1.5ml 离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。） 6、 于 4℃下 12000rpm 离心 5min。（提前开离心机预冷） 7、 将离心后的上清分装转移倒 0.5min 的离心管中放于－20℃保存。 （2）以哺乳动物组织样本为例，对其进行总蛋白提取： 1. 将 100 mg 组织剪切成小块，加入适量的冰冷 PBS 洗涤两次后，4℃，700×g（3000 rpm) 离心 3 min，弃上清。20mg 组织加入 100μl 裂解液，置玻璃匀浆器冰上均质 30～ 50 次。(如使用组织匀浆机，则按照 20 mg 组织加入 100 μl 裂解液的比例加入裂解液。 每个试管加入 2 个直径 2 mm 的磁珠。将试管放入组织匀浆机中，60 HZ，300s。充分裂 解后，10000 g 离心 5 min，取上清。) 2. 最大速度涡旋震荡 10sec，冰上放置 20 min，期间取出震荡 3-5 次,再于 4℃， 12000 rpm 离心 10 min，以沉淀组织或细胞碎片，取上清。 生工相关产品： 产品编号 产品名称 产品编号 产品名称 C500005、 细胞核蛋白/浆蛋 C510006、 C510001 RIPA 裂解液 I~IV 白抽提试剂盒 C500007、 C500008 膜蛋白、核蛋白和 动物全蛋白提取试 C510002 胞质蛋白抽提试剂 C510003 剂盒 盒 膜蛋白和胞质蛋白 石蜡包埋组织蛋白 C510005 C500058 提取试剂盒 提取试剂盒 细胞核蛋白质提取 C500009 C500049 膜蛋白提取试剂盒 试剂盒 胞质和线粒体蛋白 亚细胞结构蛋白提 C500051 C500073 质提取试剂盒 取试剂盒 植物蛋白提取试剂 一步法昆虫细胞活 C500053 C510020 盒 性蛋白提取试剂盒 一步法植物活性蛋 一步法细菌活性蛋 C510004 C500023 白质提取试剂盒 白提取试剂盒 一步法动物组织活 一步法酵母活性蛋 C500006 C500026 性蛋白提取试剂盒 白提取试剂盒 一步法动物细胞活 C500022 性蛋白提取试剂盒 蛋白定量 蛋白定量是做 WB 实验的基础。 蛋白定量的目的是：保证同一组中的不同样本的蛋白总量保持一致，只有这样，wb 结果的 内参、灰度等数据才可信。否则实验数据没有参考价值。 蛋白定量的方法很多，常用的有 Lowry 法、BCA 法、紫外吸收法、Biuret 法、这些方法各 有优缺点。应该按照具体实验选择不同的实验方法进行蛋白定量。 示例：BCA 法蛋白定量 1. 根据样品数量，按 50 体积 BCA 试剂 A 加 1 体积 BCA 试剂 B(50:1)配制适量 BCA 工作 液，充分混匀。BCA 工作液室温 24 小时内稳定。 2. 完全溶解蛋白标准品，取 10ul 稀释至 100ul，使终浓度为 0.5mg/ml。蛋白样品在什么 溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。但是为了简便起见，也可以用 0.9%NaCl 或 PBS 稀 释标准品。 3. 将标准品按 0, 1, 2