产前诊断新技术mlpa.doc

MLPA技术在产前诊断中的应用 廖 世 秀 河南省医学遗传研究所 河南省产前诊断中心 河南省人民医院 MLPA 技术的优势 多重连接依赖式探针扩增(Multiplex Ligation- dependent Probe Amplification ,MLPA): 2002年由荷兰学者Dr. SchoutenJP首次提出， 其特点 1、高通量：一管反应可同时检测40个左右 核苷酸拷贝数变化 2、极少的模板DNA：每次反应只需约10-20ngDNA 3、准确度高：每个步骤（包括数据分析） 均设计有多个内部对照 4、操作较为简单：产物可用琼脂糖凝胶电 泳分离或通过毛细管电泳等进行分离 5、成本低，便于用于大量样品分析 6、重复性强：探针的变异系数仅3% ~8% MLPA 技 术 原 理 一、染色体数目异常 ? 传统染色体核型分析至今仍是国内外染色体 产前诊断的金标准 ? MLPA技术在染色体非整倍体诊断中应用的主 要优势在于：①无需细胞培养、快速、高 效，②相对FISH和CGH简单、廉价，适于推 广 ? 目前主要应用于13、18 、 21 、 X和Y染色体 拷贝数的快速诊断 正常 男性 21 18 13 X Y . . . . . . . 正常 女性 21 18 13 X . . . . . . . 每管aneuloid反应包含8个13、18、 21、X染色体探针和4个Y染色体探针 每个峰实测面积(As)与所有峰面积 (ΣAs)平均值相除而被标准化 待测样本标化值与对照相应探针的标 化值相比较，得到比值(Ratio) 该比值即反应样本DNA拷贝数的变化 正常对照的Rito分析图： Chr.13 Chr.18 Chr.21 Chr.X Chr.Y 1 21三体综合征 18三体综合征 13三体综合征 二、MLPA技术在缺失/重复突变 产前诊断中的应用 2.1 假肥大性进行性肌营养不良（DMD/BMD） DMD是最常见的X连锁隐性遗传致死性肌病，发病 率约为1/3500活产男婴 其分子基础是抗肌萎缩蛋白（dystrophin）基因的 部分缺失、重复或点突变。约65-75%的DMD/BMD患 者是由于Dystrophin基因缺失或重复所致 1. Drosiphin基因79个外显子缺失/重复检测 正常样本琼脂糖电泳图 正常样本毛细管电泳分析结果图（ABI3130 ） 1.DMD患者Drosphin 基因缺失分析 正常对照 E48/49/50缺失 DMD2011-8 患者 E48/49/50缺失 E45缺失 E51/52/53/54缺失 DMD2011-19H E2-6缺失 DMD2011-19AF E3-8缺失 2、缺失携带者诊断 ——对于没有家族史的女性携带者判断，是目前 最有效的方式之一 DMD29CVS E46-50杂合缺失 DMD3 E8/E9杂合缺失 3、重复突变诊断 正常对照 重复突变患者 4、重复突变携带者诊断 重复突变患者 重复携带者 我 们 的 体 会 1. 特别适用于散发病例女性携带者的判断 DMD29CVS E46-50杂合缺失 如 ： 辛 某 ， 其 子 临 床 诊 断 DMD,无家族史 2008年其子行Disdrophin基 因热点区检测，结果为47、 50外显子缺失 2011年孕早期在本所进行产 前诊断（DMD2011-29），结 果为SRY-, E46-50杂合缺失 间接反映辛某为携带者可能性 极大（后经MLPA证实） 2. 在DMD产前诊断中，传统的连锁分析技术仍然 必不可少，因其 ① 可以一定程度上排除污染或 者样本混淆问题； ②佐证直接基因分析的结果 3. 尽管具备内对照，MLPA技术需要严格的外部实 验对照 SMA患者及携带者分析 同时对SMN1基因和SMN2基因的拷贝数定量分析 1. SMA基因诊断和产前基因诊断 2. SMA携带者分析 3. SMA的分子分型和预后预测 吴玉等，MLPA和PCR-RFLP技术用于脊髓性肌萎缩症的基因诊断.中国 计划生育学杂志，2008.9（155）:535-539. 22q11微缺失 22q11微缺失综合征（22q11D）是先天性心 脏病(CHD)的遗传病因之一，由其引起的CHD预 后不良 染色体22q11区域高密度多重连接探针检测技 术能快速、灵敏、精确定位诊断染色体22q11区 域基因拷贝数异常，适合于CHD的遗传学诊断 22q11微缺失或微重复引起的CHD类型多种 多样，建议所有CHD患者应常规进行遗传学检 测 胎儿超声心动图检查有异常、无论是否合并 有心外畸形，均应当进行22q11微缺失检测或 染色体核型分析，以帮助准确产前咨询