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抑制性差减杂交技术在基因克隆中的运用现状论文 摘要：抑制性差减杂交技术是一种差异性基因克隆的新技术，它对研究细胞生殖、发育、分化、衰老及死亡等生命过程中有关基因的差异表达及相关基因的分子克隆提供了有力的技术工具。简要概述了抑制性差减杂交技术的基本原理、优越性、缺陷及其在相关基因克隆方面的应用研究进展。 关键词：基因克隆；抑制性差减杂交；应用 生物体的生命过程伴有异常复杂的生物生化变化，是生物体内相关基因的有序表达和调控的结果。对相关差异性表达基因进行深入研究，能够更加深入地了解生物体的生命活动规律。目前，分离差异性表达基因的主要技术为杂交技术（subtractive hybridization）和差示筛选技术（differential scre-ening），但这些技术存在重复性差、敏感度低等缺点。随着现代 PCR 技术的发展，一系列基于 PCR 技术的分离差异性基因表达的新技术被开发出来。SSH技术就是一种利用抑制性 PCR 和以差减杂交技术为基础的一种简单、快速地分离差异性表达基因的方法，该技术在研究基因克隆、基因表达及基因功能等方面有明显的优势[1].笔者对使用 SSH 技术进行研究的应用现状及其未来前景进行了简单介绍，旨在使 SSH 技术的应用得到更加深入的认识。 1.1SSH技术的过程 SSH 研究应用的材料可以是基因组 DNA,也可以是 c DNA,用于分离克隆 2 个样品中特异基因或者是差异性表达的基因。基本过程是：抽提 2 种不同生物体的 DNA 或 c DNA;将经限制性内切酶消化后的 Tester DNA 分为 2 个部分，分别与 2 种接头连接；再将这 2 个部分序列于过量酶切的 Driver DNA杂交，当这 2 个部分 DNA 被最终混合杂交后，就允许了同源性的单链 DNA 分子杂交；通过 PCR 扩增、克隆即可分析所差减的序列。 1.2SSH技术具有的优点[2] 高效高速。在一次 SSH 杂交试验过程中，就可以同时分离出上百个差异性表达的基因。灵敏度高。在退火时，高丰度的单链 DNA 同源杂交的速度快于低丰度的单链 DNA,导致原来在丰度上有差别的单链 DNA 在相对含量上能够达到一致，从而对于低丰度的基因也可以通过基因克隆表达出来。假阳性率低。经过 2 次杂交和 2 次 PCR 扩增选择性地扩增差异表达目的 DNA ，提高了特异基因的筛出率，使得假阳性率大大降低。简单易行，对仪器设备要求不高。背景低、重复性高。 1.3SSH技术存在的不足[2] 基因组中酶切位点较少的不适用 SSH 技术；分离到的差异表达基因片段，还需要扩增全长；起始材料相对要求较多，不适于困难的样品；对试验材料的要求较高，试验材料间差异性要求较低。 2.1SSH技术在医学上的应用 孙守娟等[3]采用 SSH 技术 ,构建了舌鳞癌 Tca8113 细胞系中高、低醛脱氢酶活性细胞差异表达基因 c DNA 文库，用 Trizol 分别提取 2 个细胞的总RNA;用 SSH 技术对 2 组 RNA 进行差异基因筛选和扩增，克隆片段均匀分布在 250~750 bp,无假阳性克隆。测序结果经同源性比对分析可知 ,与肿瘤有关的基因有SLC25,A13 NPC1,KLHL2,BARD1,WAPL,Notch2,EEF2K.车红花等[4]通过 SSH 技术，克隆了受病毒攻击的宿主细胞中被中药有效成分调控的基因，结果显示，核糖体蛋白 L27a 在中药组中高表达，病毒组中表达减弱或被抑制；益气活血中药复方能够影响受 CVB3 攻击的宿主细胞核糖体蛋白 L27a 的表达，有效保护心肌、阻断病程进度，实现治疗病毒性心肌炎的目的。 李守明等[5]采用抑制性差减杂交技术，鉴定母鼠铅暴露后代海马差异表达基因，构建了一个近200 个克隆的差减基因文库，得到 93 个有效克隆，从中克隆和鉴定了母鼠铅暴露致使学习和记忆能力显着下降的幼鼠中海马差异表达的基因，共 43种不同的基因以及 4 种功能基因。这些基因包括一些看家基因和一些与细胞蛋白折叠、信号传导、应激响应及 DNA 甲基化相关功能的基因。 2.2SSH技术在植物学上的应用 刘蕾等[6]应用 SSH 筛选植物青枯菌致病相关基因，研究该菌株致病力分化机理，以 Po82 为待测菌株，构建了抑制性差减杂交文库，结果表明，具有较高的接头连接以及文库构建效率，插入片段平均长度为 300 bp,文库构建质量较好。对文库中随机挑取阳性克隆进行测序，共筛选出