临床基因扩增检测实验室核酸扩增荧光检测实验和结果分析标准操作程序.doc

临床基因扩增检测实验室核酸扩增荧光检测实验和结果分析标准操作程序 1 目的 保证扩增及结果分析的标准化、规范化。 2 使用范围 使用LightCycler型扩增仪的核酸扩增荧光检测实验室。 3 操作人 XXX 4 标准程序 4.1 核酸提取、纯化、扩增、产物分析的具体操作见项目SOP文件及仪器使用SOP文件； 注：目前，SOP文件的主要依据是生产厂家提供的检测试剂盒说明书。 4.2 核酸提取、纯化、加模板在样本处理区完成； 4.3 扩增反应体系的配制、分装在试剂处理区进行； 4.3 制备好的扩增混合液由传递窗转移至扩增区，上机扩增； 4.5 扩增程序的编程：日常检测活动中，操作者必须遵循仪器使用SOP文件规定的路径。编程或修改路径参照仪器说明书； 4.6 标本标识的传递：以标本唯一性标识中的“序列号”作为检测过程中的“检验号”进行传递； 4.7 工作安排：每一项目每周至少完成一个批次的检测； 4.8 在移取所需体积的血清及痰液后，立即盖紧原始标本管盖，将标本继续保存于-20℃冰箱； 4.8.1原始标本保存一周后丢弃； 4.8.2如患者及医生对标本结果有异议，则需在一周内及时提出意见，以便重新检测复核结果； 4.9结果分析标准程序 对于LightCycler结果曲线的分析，应按以下步骤进行：全部曲线——阴性对照——阳性对照——阳性室内质控品——阳性标准品——逐个分析（标出阳性标本和可疑标本）——调整参数，获得较好的标准曲线，显示定量结果——登记，发报告。 4.9.1 整体曲线的观察 将所有曲线选中进行整体观察 a）观察是否存在污染情况（包括标本污染和试剂污染），特别应注意大量曲 线在同一Ct值出现上涨的情况。 b）观察是否有光路传导阻滞或电压波动等机器原因形成的异常曲线。 4.9.2 阴性对照的分析 阴性对照：试剂中加入与待检标本进行同样处理的已知阴性标本。 作用：用以监测实验室和前处理过程中是否存在污染。 4.9.3 阳性对照的分析 阳性对照：试剂中加入与待检标本进行同样处理的已知阳性标本。 作用：用以监测实验能否正常检出阳性标本，避免假阴性的出现。 4.9.4 阳性室内质控品的分析 阳性室内质控品：试剂中加入与待检标本进行同样处理的已知或未知浓度的阳性室内质控血清。 作用：用以监控日常实验的精密度。 4.9.5 阳性标准品的分析 a）各梯度曲线的分布是否均匀，若各梯度曲线均未分开，则表明阳模稀释可能存在问题，提示实验中存在较大人为误差。 b）观察各曲线的Ct值是否在平日的正常位置。 情况1：若出现低拷贝标准品做不出，而各曲线Ct 值均后移，则判断是否 为试剂扩增效率下降（如试剂过期或保存条件不合格）。 情况2：出现低拷贝标准品做不出，而高拷贝曲线Ct值均正常，则提示可能存在低拷贝阳性标准品的降解情况。 c）每日必做103标准品，用作以下三方面监控： 一是否存在操作误差，如加样量过少等原因导致103标准品未能检出；二是否存在稀释后的梯度放置过久，低拷贝标准品降解的情况；三是若高拷贝标准品出现Ct值后移，且能排除情况a、b，则判断是否为试剂灵敏度下降。 4.9.6 单个曲线的判断 逐个分析每条曲线，判断曲线的阴阳性或属可疑曲线。（可疑标本是指曲线在37个Ct值后出现上涨且平台趋势不明显或上涨幅度比较低的标本。可疑标本要第二天重做，两次结果一致则报阳性，否则结果报阴性。）曲线观察内容：在基线选择2～8时观察△Rn值大小（是否有三期特征）。在基线选择0～0时观察Rn值曲线形状。 4.9.7 得出定量结果 调节基线和阈值以得到一较好的标准曲线。电脑据此曲线给出阳性结果值。此时应排除某些阴性标本因荧光曲线假性上扬而得出的假阳性结果和某些弱阳性标本因终末荧光值过低而显示的假阴性。 4.9.8 发放报告 及时登记检测结果记录，发放临床报告。 5 本SOP的变动程序 本SOP的变动，可由任一使用该文件的工作人员提出，报上级负责人决定。如通过则公布实行。 起草人 批准人 启用日期 XXX XXX 2003年2月10号