【通用】PCR技术的原理及应用.pptVIP

与目标序列互补 TaqMan---水解型杂交探针 5′端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等 3′端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q) 探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收 ，无荧光， R与Q分开，发荧光 （荧光共振能量转移原理，FRET） Taq酶有 5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针 精选 TaqMan法 工作原理 每扩增一条DNA分子，释放一个荧光信号，可以在循环过程中任一点检测荧光 精选 TaqMan 法 PCR反应的建立 1、引物、探针的设计： 探针Tm为68-70℃ ，30 bp, 5’不能有G，G可能会淬灭荧光素， 引物尽量靠近探针，扩增片段400 bp，引物Tm为59-60℃ 2、反应参数的确定： 一般为：94 ℃，10-20S 60℃，30-60S（Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃ 最高） 也可通过温度梯度优化退火温度 72 ℃，45 S， 3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，最大信号/背景比值