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酵母菌的分离与纯化 土壤是微生物生活的大本营， 是寻早有重要应用潜力的微生物的主要菌源。 不同图样中各类 微生物的含量不同，一般土壤中细菌数量最多， 其次为放线菌和霉菌。 放线菌一般在较干燥、 偏碱性、有机质较多的土壤中较多； 霉菌在含有机质丰富、偏酸性、通气性较好的土壤中较 多；酵母菌在一般土壤中的数量较少，而在酒曲、面肥、水果表皮、果园土壤中数量多些。 菌源 1 土样 用无菌的采样小铲在橘树果园中取土壤表层下 1~10cm土壤10g,装入灭菌的牛皮纸 袋内。封好袋口，记录取样地点、环境及日期。图样采集后应及时分离，饭不能立即分离的 样品，应保存在低温、干燥的条件下，以减少其中菌相的变化。 2面肥 面粉500克，白酒100克，水250,和好静置发酵就可以了。冬季 10个小时。 在温水中兑一点酒，倒入适量面粉拌匀后放入绝缘保温盛器(陶瓷，砂锅)中， 用布将整个盛器盖好置于温度较高处， 6小时后即成面肥。 *以上方法做出的面肥只能保存几天，不宜放置太久。 3水果果皮 桔子和葡萄等的果皮上含有数量较多的酵母菌， 既可单独作为菌源也可以和果园土壤 作为混合菌源。 酵母菌的分离 1制备菌悬液 称取菌源1g,加入盛有 99ml无菌水或无菌生理盐水并装有玻璃珠的锥形瓶中。振荡 20min ,即成10-2的菌源悬液。再一次稀释成 10-4、10-5、10-6三个稀释度。 2涂布法分离 取融化并冷却至 45~50度左右的豆芽汁葡萄糖培养基，每皿分别倾注约 12ml培养基 到培养皿内。注意，温度过高易将菌烫死，皿盖上冷凝水太多也会影响分离效果；低 于45度培养基易凝固，平板高低不平。呆平板冷却后，用无菌移液管分别吸取上述 已经制好的菌源稀释液 10-4、10-5、10-6三个稀释度菌悬液各 0.1ml ,依次滴加于相应 编号的豆芽汁葡萄糖培养基平板上。每个稀释度做 2~3个平行皿。左手拿培养皿，并 用拇指将皿盖打开一缝， 再火焰旁右手持无菌玻璃涂棒将菌液自平板中央均匀向四周 涂布扩散。注意，切忌用力过猛，这样会将菌液直接推向平板边缘或将培养基划破。 3培养 接种后，平版倒置于 30度恒温箱中，培养 2~3天,观察结果。 4纯化 用接种环挑取单个单个酵母菌菌落，在平板上四区划线，培养后分离得到单个菌落。 酵母扩培方案 一、培养基制备 麦芽汁培养基的配制 .培养基成分 新鲜麦芽汁一般为10-15波林。 2.配制方法 用水将大麦或小麦洗净，用水浸泡 6-12h,置于15C阴凉处发芽，上盖 纱布，每日早、中、晚淋水一次，待麦芽伸长至麦粒的两倍时，让其停止发芽， 晒十或烘干，研磨成麦芽粉，贮存备用。 取一份麦芽粉加四份水，在65 C水浴锅中保温3-4h，使其自行糖化，直 至糖化完全(检查方法是取0.5ml的糖化液，加2滴碘液，如无蓝色出现，即表 示糖化完全)。 糖化液用4-6层纱布过滤，滤液如仍混浊，可用鸡蛋活澄活 (用一个鸡 蛋消,加水20 ml,调匀至生泡沫，倒入糖化液中，搅拌煮沸，再过滤 )。 用波美比重计检测糖化液中糖浓度，将滤液用水稀释到 10-15波林，调 pH至6. 4。如当地有啤洒厂，可用未经发酵，未加洒花的新鲜麦芽汁，加水稀 释到10-15波林后使用。 如配固体麦芽汁培养基时，加入 2%琼脂，加热融化，补充失水。 分装、加塞、包扎。 高压蒸汽灭菌 100 Pa灭菌20 min。 马铃薯葡萄糖培养基的配制 1、培养基成分 TOC \o 1-5 \h \z 马铃薯 20g 葡萄糖 2 g 琼脂 1.5-2g 水 100ml 自然pH .配制方法 配制20%马铃薯浸汁 取去皮马铃薯200g,切成小块，加水1000ml 80C 浸泡lh ,用纱布过滤，然后补足失水至所需体积。100 Pa灭菌20 min。即成20% 马铃薯浸汁，贮存备用。 配制时，按每100 m1马铃薯浸汁加入2g葡萄糖，加热煮沸后加入2g琼脂, 继续加热融化并补足失水。 分装、加塞、包扎。 高压蒸汽灭菌 100 Pa灭菌20 min。 豆芽汁葡萄糟培养基的配制 1.培养基成分 TOC \o 1-5 \h \z 黄豆芽 10g 葡萄糖 5g 琼脂 1.5-2g 水 100ml 自然pH 2 .配制方法 称新鲜黄豆芽10g,置于烧杯中，再加入100 m1水，小火煮沸30 min,用 纱布过滤，补足失水，即制成10%豆芽汁。 配制时，按每100 m1 10%豆芽汁加入5g葡萄糖，煮沸后加入2 g琼脂， 继续加热融化，补足失水。 分装、加塞、包扎。 高压蒸汽灭菌 100 Pa灭菌20 min。 察氏(czapck) 培养基 的配制 1.培养基成分 TOC \o 1-5 \h \z 蔗糖 3g NaN03 0.3g K2HP04 0.1g KCl 0.05g MgSO4 7H2