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非编码ＲNA研究技术总结 长链非编码ＲNA（lｏｎg　ｎoncodinｇ RNA，lｎcＲNA）是一类长度>２00bｐ的RNA，由ＲNＡ聚合酶Ⅱ转录，lｎcＲNA具有保守的二级结构,大部分不编码蛋白质。LncRNA发挥功能的方式很广，可以与蛋白、DNA和RＮA相互作用，参与多种生物学过程的调控。主要包括基因组表观遗传修饰、调控转录后翻译、发挥ceＲNA、增强子RNＡ作用等，从而对细胞的增殖、分化、迁移、凋亡、免疫等发挥调控作用。 非编码ＲＮA可火了，miRＮＡ大火烧了十几年,现在慢慢地把lnｃＲNA的领域也给点着了。现在可能连实验室的插枪头阿姨都知道绝大多数的RNA分子并不翻译,这非编码RNA(noncoｄiｎg　RNA)，包括miＲNA、ｌncRＮＡ等。 目前主要研究方向集中在非编码RNA 及其相互结合的ＤNA、RＮA、蛋白质等科学问题,而科学问题的解答依赖于实验技术的创新使用和革命。 IncRNA可以海陆空全面调控细胞功能,厉害了,其实主要指lncRNA,而ｍiRNA、siRNA主要作用于mRＮA层面，本文按非编码ＲNA的三个调控维度，就当前主要的实验技术简单介绍一下。 (一)ＤNA维度 1）作用的ncＲNA类型:lnｃRＮA等 2)研究方法介绍有: 和ＤNA序列结合的调控目的无非是①阻止下游基因的转录②把转录因子、甲基化酶等招惹过来修饰DNＡ序列。他们的共同特点是和解链的DNA的某一条链结合,那么研究方法包括 1．　 RNA原位杂交(RＮAｉn situ hybridiｚatioｎ) 检测该nｃRNＡ是否位于核内,如果不在核内，那就不用考虑和ＤＮA作用了。 RＮA原位杂交是指将特定标记的已知顺序核酸为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交，从而对特定核酸顺序进行精确定量定位的过程。原位杂交可以在细胞标本或组织标本上进行。根据RNA序列设计ｃDNA、cRＮA探针，对目标进行定位。 ２. ＣhIRP(chｒoｍatin isolation by RNA pｕrｉficatiｏｎs） 是一项通过纯化RNA 分子从而获得其结合的染色质片段( 包括ＲNA　结合蛋白与基因组DNA） 的实验方法。 大概流程：首先细胞交联,使lncRNA、染色质及被固定连接；随后通过超声将染色质打断,并使用带有生物素标记的tiling oliｇｏs与长链非编码RNA 分子杂交；之后利用亲和素磁珠纯化长链非编码RNA 及其结合的染色质片段；后续分析和测序。 3． nｃRNA-DＮA三联体的体外同位素检测 为了进一步检验这种调控机制和结合方式,可以在体外分别合成此ｎcRNA和ＤNA片段,并用同位素(P32)标记，在体外做结合实验,如果不结合,那么就会呈现两条已知的条带,如果能够结合，那么就会有一条ＲNA-ＤNＡ分子量新条带出现。 （二）RNA维度 1)作用的ｎcＲＮＡ类型:mＲＮＡ-miRNA-ｌncRNA+circRＮA等 2)研究方法 既然是ＲNA-RNA相互作用，除了胞内FISH定位技术以外,还有其他技术要使用,如下 1.ＣLASH (cｒｏsslinkｉｎｇ－ligation anｄ ｓｅquencｉng ofｈyｂrids) 对RＮA 分子与RNＡ 分子相互作用进行研究的实验系统,主要被用于鉴定mｉRNA 与其靶mRNＡ 的相互作用。大概流程为：首先对细胞进行交联处理,将ｍiRNＡ 及其靶mRNA 与RＩSC　复合物固定连接;随后通过Co-IP富集纯化ＲISＣ　复合物;之后再通过分子内连接将miRＮA　的3＇-OH　末端与靶ｍRＮA 的5＇-PＯ4　末端连接,形成一条长的单链RNA，然后测序。 2．CHART(CaptureHybrｉｄization Analyｓis of ＲＮA Taｒｇeｔs） 也可以叫做ＲNA prｅciｐiｔation，根据ncRNA序列设计探针,二次探针交联在固相载体上，若将核内RNＡ-ＤNＡ状态固定处理，染色质超声打碎成小片段，RＮA-ＤNA的结构就可以被探针抓取下来，利用DNＡ-Sｅq对抓取的DNA进行测序,获得ＤNＡ结合序列的信息(不过这个可以被生信分析工具所预测一下)。 3.荧光素酶报告系统 在荧光素酶报告基因载体的报告基因编码区的下游插入ncRNＡ结合序列或者ｍRNA的3’　ＵTR区，然后将构建好的载体转染细胞并改变细胞中相应ｍiＲNA的表达水平,通过检测荧光素酶的表达情况以分析ncRＮA或者mRNA的3’　ＵTＲ区中是否含有miRNA的靶位点。同理任意两种RＮＡ-ＲＮA互作都可以利用这个原理。 (三)蛋白质维度 1)作用的ncＲNA类型：lｎcＲNA、mRNA较多 2)研究方法: 这种互作模式是RNA－Ｐｒｏｔeｉn,那么ncＲNA可以和调控DNA的蛋白结合,也可以和细胞质内的蛋白质结合,发挥不同效应。