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最新整理资料 文档精选合集 最新整理资料 文档精选合集 样品低温保存 技术手册 合作伙伴： 样品低温保存技术手册 Nalge Nunc International 由 Nalge Nunc International 公司与 Frank P. Sinione，理学硕士（Master of Science), 美国菌种保藏中心 （ATCC) 合作撰写。 ?2006 Thermo Fisher Scientific 目录 简介 1 种批系统（Seed Lot System） 1 冻存保护剂 2 生物材料准备 2 平衡 4 安瓿瓶和冻存管 4 降温速率 5 样品储存 5 复苏（解冻） 6 复苏率鉴定 7 在库控制 7 生物材料管理实践 7 安全注意事项 8 细胞培养操作步骤（非干细胞） 8 精选文献参考 9 简介 为了保证科学研究和生物医学研究的可持续性和实验结果的可重复性，如何保证活细胞和微生物中遗传复制物质的稳定性， 以及怎样保持如核酸和蛋白质等亚细胞组分的稳定不变，是当今科学家面临的重大问题之一。细胞传代培养十分耗时，另外，由于极易发生污染或遗传漂变等问题，导致只有越来越少的细胞可用来传代。不恰当的储存和处理不可重复性样品，会导致实验结果的差异性和不可重复性。然而，将部分活细胞或亚细胞组分悬液放置在冻存低温储存，可以达到“暂停时间”的效果，这样便可获得组织材料的遗传稳定性，方便各种实际操作的应用。 作为低温生物学的一项实际应用，在冻存温度使生物材料保持稳定的过程叫做样品低温保存。冻存科技的不断发展，实现了维持不同生物材料的稳定性，如组织材料，各类细胞以及亚细胞组分材料。当前已发展出包括微生物、组织、原代细胞、细胞系、小型多细胞器官，复杂细胞状结构如胚胎，以及核酸和蛋白等材料的冻存技术。 冻存过程涉及很多复杂现象，即使经过了数十年的研究，具体机制仍不甚清楚。冻存生物学的研究主要针对如下问题：活细胞在冻存过程中发生了什么变化？如何克服冻存过程中的不利现象？因为水是所有活细胞的主要组成部分，并且直接影响细胞内生物化学反应。当细胞中所有水分子都转化成冰晶时，细胞的新陈代谢也就停止了。 降温过程中冰晶以不同速率形成。缓慢降温过程中，胞外冰晶先于胞内冰晶形成 1。随着细胞外部冰晶的逐渐形成，胞外环境的水分子减少导致细胞膜内外渗透压不平衡，胞内水分子向胞外迁移。进而导致，细胞内外液体浓度的增加对细胞存活有害 1。所以，如果细胞内保留过多水分子，冰晶形成及重结晶过程会对细胞造成致命伤害。 图 1 使用 1℃ / 分钟的降温速度和冻存保护试剂，将最小化由渗透压失衡和冰晶形成对细胞造成的损伤 降温速率对细胞冻存具有很大影响（图 1）。快速冻存可以大大减少胞内外液体浓度改变造成的影响，使得形成形状规则的冰晶，但是，由于水分子未完全迁移至胞外容易形成较多的胞内冰晶。相反，缓慢冻存可以使得细胞内水分充分渗出，减少胞内冰晶，但是却提高了胞内外液体浓度改变对细胞造成的影响。细胞透性影响水分流失的速率，透性较好的细胞更耐受速冻 2。 Mazur 认为3，冰晶形成和细胞内外液体浓度改变均影响细胞损伤。优化降温速率能同时将二者的影响降到最低。毫无疑问，每分钟降低 1℃的降温速率最为合适。 使用冻存保护剂或化学物质可以在冻存的过程中保护细胞， 减少细胞内外液体浓度改变和形成冰晶对细胞产生的影响。常用的冻存保护剂是二甲基亚砜（DMSO）和甘油，还有一些其他保护剂用于某些特殊应用。另外，采用合适的储藏温度以及恰当的 复温速率，也有利于降低对细胞和组织产生的伤害。 良好冻存流程的关键因素之一为标准化操作过程。由于冻存操作的复杂性，操作时微小的变化都会对生物材料造成显著的影响。标准化冻存流程可以很大程度地保障实验结果的连续性和可比性。因此，一旦制定了一个成功的冻存流程标准，需要非常仔细的记录此套方法。 种批系统（Seed Lot System） 为了保证细胞的遗传稳定性，原代细胞培养成稳定细胞系后需尽量减少传代次数。当您进行细胞冻存时，需要建立一个系统确保早期传代的细胞材料始终可以进行传代，产生新的可用细胞。保存早期传代的细胞材料的方法之一是使用种批系统 (Seed Lot System)4。 在第一批冻存细胞的准备阶段，需要预留出一部分细胞作为种子材料。这部分细胞被保存于特定冻存管中，且与日常工作用冻存细胞分开放置，防止种子材料被当做工作用冻存细胞使用或进行复苏操作（图 2）。当第一批工作用冻存细胞使用完毕后， 可从种子材料中取出一支用于生成第二批工作用冻存细胞。以此往复，直到仅剩一支种子材料。最后一支种子材料用于生成第二批种子材料。采用这种方法，第二批种子材料由原代材料算起， 仅仅经过 1-2 次的传代，但如果