蛋白磷酸化修饰的生物质谱分析.doc

14-3-3ε蛋白磷酸化修饰的生物质谱分析 第期 第卷 分析化学 研究报告 ~ 年月:./.... ..
蛋白磷酸化修饰的生物质谱分析 刘宁妈 李子健 何鑫 潘晨宇 北京大学第三医院血管医学研究所,卫生部心血管分子生物学与调节肽重点实验室, 分子心血管学教育部重点实验室,心血管受体研究北京市重点实验室,北京 吉林大学化学学院,长春 吉林大学第院,长春 摘要本研究在细胞中过表达带有个组氨酸标签的蛋白,经镍离子亲和树脂富集和凝 胶电泳等生物化学方法分离并富集目标.蛋白。利用特异性胰蛋白酶对蛋白进行胶内水解 后,采用:亲和层析法,对蛋白水解混合物中的磷酸化修饰肽段进行富集,并利用生物质谱技术分析鉴定 了?蛋白中的磷酸化修饰位点。结果表明,利用生物质谱技术,结合人工解谱的方法,能够高效、准确 地鉴定细胞中过表达的?.占蛋白中的磷酸化修饰肽段的结构信息,确定了蛋白中的 个磷酸化修饰位点,其中多个位点的磷酸化修饰为首次发现。 关键词质谱;蛋白;磷酸化修饰 引 言 .蛋白是等于世纪年代在研究脑蛋白质系统分类时发现的,根据这类蛋白质在 纤维素膜层析中的片段数以及它在淀粉凝胶电泳上的迁移位置而命名¨。蛋白为酸性蛋 白质,分子量约~ , ~。在哺乳动物中存在种异构体卢,占,,田,,丁,;原命名的 和实际是口和的磷酸化形式,主要以同源/异源二聚体形式存在。?蛋白是广泛表达的蛋 白家族,主要存在于神经组织内,在心、肝、肾、小肠和睾丸等几乎所有组织中表达。..蛋白的主要 功能是作为接头蛋白与其它蛋白质结合,进而通过多种机制调节它们的生物学功能旧~。有证据显示, ?.蛋白的许多重要的生物学功能是通过其本身的磷酸化修饰来介导、调节和完成的。例如,鞘氨醇 依赖性蛋白激酶可使蛋白发生磷酸化修饰,进而调节细胞信号转导旧。激酶能 够磷酸化?,磷酸化的.口进而负调控和相互作用,调节细胞信号转导归。 激酶能够磷酸化?,从而诱导神经细胞凋亡,调控癫痫疾病的发生发展¨。关于蛋白翻译 后修饰特别是磷酸化修饰的种类和位点的研究鲜有报道。因此,研究蛋白的翻译后修饰,特 别是其磷酸化状态,对于深入认识?.蛋白在信号转导过程中的精细调控作用机制具有重要意义。 蛋白质结构分析中最具挑战性的应属对各种翻译后修饰的分析,这主要是由于蛋白质翻译后修饰 的丰度低、动态范围大等因素造成的。并且,各种修饰会随机体所处的生理环境的变化,呈现出较大差 别。现代质谱技术以其高分辨率和高灵敏度等优势成为了生物大分子,特别是蛋白质分子结构分析中 最重要的技术手段之一¨ 。当前的质谱技术可以对蛋白质的许多种类的翻译后修饰如磷酸化修饰 进行定性、半定量、甚至定量分析。蛋白具有多个亚型,各个亚型在不同组织、细胞类型中的分布 不尽相同。而蛋白质各个亚型之间不但氨基酸序列互有差异,而且翻译后修饰状态在同一的生理环境 下也差别很大。本研究利用分子生物学手段,在特定的细胞中过量表达某一特定亚型的.蛋白, 进一步通过高特异性的镍离子亲和树脂富集,获得纯度较高、氨基酸序列均一的特定亚型目标 蛋白,建立了?蛋白磷酸化修饰的质谱分析方法。不仅消除了其它种类亚型蛋白对实验结果的干 扰,还可通过放大细胞培养的规模,获得足量的目标蛋白,从而检测到一些低丰度的磷酸化修饰状态。 本研究在细胞中过表达带有个组氨酸标签的蛋白,经镍离子亲和树脂和凝胶电 收稿;接受 本文系国家重点基础研究项目.、国家自然科学基金№.,,、北京市自然科学基金 .、吉林省科技发展计划.和吉林大学白求恩计划.资助 ?: .. 万方数据分析化学 第卷 泳等生物化学方法分离并富集目标占蛋白,进一步经胰酶水解获得其肽段混合物。采用:亲 和层析法,对磷酸化修饰肽段进行了富集,并利用毛细管反向高效液相色谱和质谱联用技术分析鉴定了 ?蛋白中的磷酸化修饰位点,其中多个位点的磷酸化修饰为首次发现。 实验部分 .仪器与试剂 电场轨道阱回旋共振组合质谱仪公司;测序级修饰的胰蛋白酶. 公司;蛋白定量试剂盒、。,、二硫苏糖醇、碘乙酰胺?公司;镍离子亲和树 脂 公司;:亲和吸头、甲酸、乙腈、届巯基乙醇公司;其它试剂均为国产分析 教授惠赠。 纯。一表达质粒由美国大学 .镍离子亲和树脂富集蛋白及电泳 将一??质粒转染细胞。 后裂解细胞,将裂解上清液与镍离子亲和树脂柱孵育 / 。利用清洗缓冲液清洗镍离子亲和树脂柱次,加入×上样缓冲液%,%甘油, ., , /届一巯基乙醇,微量溴酚兰沸煮 ,使..蛋白从镍离子亲和树脂 柱上分离,%进行分离,电泳后凝胶应用考马斯亮蓝染色,扫描仪进行扫描成像。 .蛋白质样品的胰蛋白酶水解及磷酸化肽段富集 将位于 处的蛋白染色条带切下,在脱色缓冲液/ 。,,%‖乙腈中 脱色直至蓝色消失。将脱色后的凝胶条带在%/二硫苏糖醇溶液