FACSCanto流式细仪原理.ppt

常用荧光染料的特性 荧光染料 激发波长 (nm) 发射波长 (nm) 用途 颜色 FITC 488 525 免疫荧光 绿色 PE(RD1) 488 575 免疫荧光 橙色 PerCP 488 670 免疫荧光 深红 APC 633 670 免疫荧光 红色 PI 488 620 DNA 染色 橙红 ECD 488 620 免疫荧光 橙红 PeCy5 488 675 免疫荧光 红 常用荧光染料 (488nm,633nm 激发 ) ? Fluorescein Isothiocyanate (FITC) ? 异硫氰酸荧光素 ? Phycoerythrin (PE) ? 藻红素 ? Allophycocyanin (APC) ? 异藻蓝蛋白 ? Peridinin-Chlorophyll Protein (PerCP) ? 多甲藻黄素 - 叶绿素蛋白 ? Tandem Dyes ? PE-Texas Red (ECD) ? PE-Cy5 (PC5) ? PE-Cy5.5 (PC5.5) (futures) ? PE-Cy7 (PC7) (futures) FACSCanto Ⅱ 信号检测组件 ? 种类 ? 八角形 ? 三角形 ? 构成 ? 检测器 ? 滤片 FACSCanto Ⅱ 信号检测组件 ? 八角形检测组件 FACSCanto Ⅱ 信号检测组件 ? 三角形检测组件 FACSCanto Ⅱ 信号检测组件 ? 检测器 ? 鞘液流中的颗粒通过激光束时会产生光信号， 光信号到达检测器生成电脉冲信号，电子系 统对电脉冲信号进一步处理。 ? FACSCanto 两类检测器 ? 光电二极管： FSC ? 光电倍增管 PMT ： SSC 和荧光信号 FACSCanto Ⅱ 信号检测组件 ? 光学滤片用于调整光谱的分布。 ? 当光子遇到滤片时，光子或通过滤片，或被 滤片吸收，或被滤片反射。 FACSCanto Ⅱ 的滤片 ? 长通滤片（ LP ）：长于设定波长的光通 过，并反射短于设定波长的光 FACSCanto Ⅱ 的滤片 ? 带通滤片：允许一定带宽波长的光通过。 FACSCanto Ⅱ 的滤片 FACSCanto Ⅱ 的滤片 FACSCanto Ⅱ 电子系统 ? 将与电脉冲信号 强弱相关的电压 数字化 ? 有三类电脉冲信号 ? 高度信号 H ? 面积信号 A ? 宽度信号 W 几个概念 ? 信号放大 ? PMT 将光信号转换成电信号，调整 PMT 的电 压，信号强度将随之改变。 ? 阈值 ? 信号放大过程会产生不需要的脉冲信号，通 常来自于碎片。通过设定某一信号的最低强 度值，可将不需要的脉冲信号去除，这一设 定值称为阈值。 几个概念 ? 颜色补偿 ? 采用合适的方法校正荧光染料之间叠加所造 成的误差。在完成双色以上荧光标记的样本 时，都需要作颜色补偿。 颜色补偿 ? FITC 主要由 FITC 的检测器检测，但部分 光也会进入 PE 检测器 几个概念 ? 颜色补偿 ? 带通滤片接受的是一定带宽波长的荧光，故 会有干扰光同时被接收，然后一同进入 PMT 进行光电转换并放大。 几个概念 ? 颜色补偿 ? 通常干扰光占该染料所发出荧光总量的 X% 补偿模型图 颜色补偿判断标准 ? 未作颜色补偿 颜色补偿判断标准 ? 补偿后 怎样进行颜色补偿 ? Comp Beads ? 用