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第二章 蛋白质的理化性质及其分离和提纯;一、氨基酸的性质;注意：;练习：;基于aa所带基团均可解离； 酸碱滴定法； 得到弱酸弱碱曲线； 根据aa上可解离基团的pK值计算等电点： pK：解离常数。 ;R-;两边取负对数： -lg [H+ ] 2 = - lg K1 － - lg K2 ∵ -lg [H+ ] = pH - lg K1 = pK1 - lg K2 = pK2 ∴ 2 pH = pK1 + pK2 令 pI为等电点时的pH，则 pI = ? （ pK1 +pK2） Gly：pI = ?（2 .4 + 9.6) = 5.97;由此可知: 等电点相当于该aa两性离子状态两侧  基团pK值之和的一半。 ;对有三个可解离基团的氨基酸：;如：天冬氨酸;如赖氨酸：;(二) 氨基酸的脱羧反应;（四）受热反应;（2）β-氨基酸受热;（五）与茚三酮反应;天然蛋白质分子的20种氨基酸，以色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸对紫外光有较强的光吸收。其吸收峰在280nm左右，以色氨酸吸收最强。 可利用此性质采用紫外分光光度法测定蛋白质的含量。 紫外吸收性受溶液pH的影响。 ;二、蛋白质的性质;蛋白质分子表面的水化膜和表面电荷是稳定蛋白质亲水溶胶的两个重要因素。;蛋白质颗粒的表面电荷和水化膜;物理因素：加热、高压、搅拌、X-射线、紫外线、超声波 化学因素：强酸、强碱、脲、重金属盐、有机溶剂、生物碱等;变性蛋白质的性质改变： ① 物理性质：旋光性改变，溶解度下降，沉降率升高，粘度升高，光吸收度增加等； ② 化学性质：官能团反应性增加，易被蛋白酶水解。 ③ 生物学性质：原有生物学活性丧失，抗原性改变。 ;核糖核酸酶的变性与复性;蛋白质分子相互聚集而从溶液中析出的现象称为沉淀;特点：盐析法沉淀的蛋白质没有变性，去盐后活性恢复。;;盐析;分段盐析： 半饱和硫酸铵溶液可沉淀分子量较大的蛋白，而饱和硫酸铵溶液可沉淀分子量较小的蛋白。因此，使用不同浓度的硫酸铵溶液就可将分子量不同的蛋白质进行初步分离。;(3) 重金属盐沉淀： 铅、铜、汞等重金属的盐类能使蛋白质凝结变性，所以能使人中毒。万一不慎误服了重金属离子，可立即喝大量的牛奶、鸡蛋清等来缓解毒性，以减少人体内蛋白质中毒的程度。;加热使蛋白质变性并凝聚成块状称为??固。 凝固的蛋白质一定发生变性。 ;（四）蛋白质的颜色反应;三、蛋白质分离提纯的一般原则; 蛋白质应该如何进行鉴定? 在蛋白质纯化过程中，为了进行蛋白质的追踪，必须有一个快速、重复性好而且灵敏的鉴定方法。此鉴定方法还应该是经济的，能在小体积下进行操作，而且不要求采用昂贵的仪器。;蛋白质分离提纯的一般程序;粗分级：当蛋白质混合物提取液获得后，选用一套适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白质分离开来。 一般这类的分级用盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法。 特点是简便、处理量大，既能除去大量杂质，又能浓缩蛋白质溶液。;结晶：蛋白质分离提纯的最后步骤。 尽管结晶并不能保证蛋白质的均一性，但只有某种蛋白质在溶液中数量上占优势时才能形成结晶。 结晶过程本身也伴随着一定程度的提纯，而重结晶又可除去少量的夹杂蛋白质。由于结晶中从未发现过变性蛋白质，因此蛋白质的结晶不仅是纯度的一个标志，也是断定制品处于天然状态的有力指标。 蛋白质的纯度越高、溶液浓度越浓就越容易结晶。结晶的最佳条件是使溶液略处于过饱和状态，这可以借控制温度、加盐盐析、加有机溶剂或调节pH等方法来达到。;蛋白质的分离;加压; 按膜的孔径或被分离物的体积大小： （a）5000 nm以上，微粒过滤膜。 （b）100～5000 nm，微滤膜，可分离血细胞、乳胶等。 （c）2～100 nm，超滤膜，可用于分离蛋白质等。 （d）～ 10 ?，纳滤膜，可用于分离游离酸和糖等。 （e）～ ?，反渗透膜（超细滤膜），可分离 NaCl等。;密度梯度（区带）离心：高分子颗粒的沉降不仅决定于它的大小，也取决于它的密度。如果高分子颗粒在具有密度梯度的介质中离心时，质量和密度大的颗粒比质量和密度小的颗粒沉降得快，并且每种高分子颗粒沉降到于自身密度相等的介质梯度时，就停滞不前，最后各种高分子在离心管中被分离成各自独立的区带，并于离心管的底部被收集。;凝胶过滤，即凝胶过滤层析：这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。当不同分子大小的蛋白质混合物流经凝胶层析柱时，比凝胶网孔大的分子不能进入珠内网状结构而被排阻在凝胶珠外，随溶剂在凝胶珠之间的空隙向下移动并最先流出柱外；比