硫酸软骨素的精制与纯化.pptVIP

CPC硫酸软骨素复合物需要经解离方可回收硫酸软骨素，方法主要有以下三种 1、复合物溶于盐溶液：用小于4mol/L的氯化钠，在40oC下不断搅拌解离，解离后加入3～5倍体积乙醇，硫酸软骨素沉淀析出，或向解离液中加入碘盐或硫氰酸盐，以去除季铵盐离子；解离液中的季铵盐离子也可用有机溶剂抽提去除 2、季铵盐-硫酸软骨素复合物溶于有机溶剂：将复合物先经水洗涤除去无机盐后，37oC下加入丙酮或乙醇，所得溶液用不能溶于上述溶剂的无机盐，硫酸软骨素即可与加入的无机盐中的阳离子形成不溶性沉淀析出 3、季铵盐-硫酸软骨素复合物充分粉碎后，用无机盐饱和的乙醇震荡数小时，复合物中季铵盐离子即与无机盐中的阳离子发生交换，不溶性的硫酸软骨素可经离心或过滤收集 目前，CPC法已经发展成一种既适用于微量分析，又可用于大规模生产的方法 CPC-盐梯度纯化法：将糖胺聚糖混合液溶于盐溶液，加入CPC(CPC预先溶于等浓度的盐溶液，浓度为10%)，逐步稀释混合液，分批收集沉淀；或将混合糖胺聚糖水溶液与3倍CPC混合，随后逐步升高盐浓度分批解离使硫酸软骨素得以纯化 硫酸软骨素A、C结构相似，单独用CPC法进行分离是非常困难的，但两者的CPC复合物在有机溶剂中的溶解度存在差异，因此可采用CPC-纤维素柱结合加以分离，如硫酸软骨素A可以40%丙醇/20%甲醇/1.5%乙酸洗脱，而硫酸软骨素C则保留在柱上 艾杜糖醛酸和葡萄糖醛酸pK值存在差异（分别为3.6和3.1），因此可在合适的条件下加以分离，在适当的酸性条件下，当艾杜糖醛酸的解离受到抑制时，硫酸皮肤素-CPC复合物的溶解度大大低于硫酸软骨素，此时如在0.1mol/L HAc/0.7mol/L MgCl2溶液中，硫酸皮肤素析出，而硫酸软骨素保留在溶液中 根据硫酸化程度的不同，硫酸软骨素可分为三组：非硫酸化的软骨素、单硫酸化的硫酸软骨素、多硫酸化的硫酸软骨素，糖胺聚糖-CPC可溶于某些有机溶剂，当和这些复合物的丁醇溶液相平衡的水相发生微小的盐浓度变化时，有机相中的硫酸软骨素即可向水相转移，据此，逐步提高水相的盐浓度，即可分离不同硫酸化程度的硫酸软骨素 需要指出的是，由于各种硫酸软骨素在分子量、硫酸化程度及方式和糖醛酸组成等方面的不均一性，因而企图把消化液中的硫酸软骨素混合物分离成单一纯组分往往是不合实际的 下图为Sigma公司硫酸软骨素C标准品的液相分析 可见，即便是Sigma公司硫酸软骨素标准品，也不可能做到结构的绝对均一 糖胺聚糖在水溶液中经有机酸、碱或盐处理即发生不溶性沉淀，其中部分反应已用于糖胺聚调的分离纯化中 透明质酸和肝素在高浓度乙酸溶液中能直接沉淀析出 透明质酸在高浓度硫酸铵溶液中可被吡啶沉淀 肝素与盐酸联苯胺可发生专一性沉淀 牛肺提取液中经硫酸钡-乙酸沉淀，结合其他方法能得到硫酸角质素纯品 不同糖胺聚糖的钾盐在相同条件下溶解度有很大差异，应用此原理可以分批沉淀不同糖胺聚糖：如硫酸角质素溶解度为3mg/mL，硫酸软骨素为0.5mg/mL，肝素为0.06mg/mL 离子交换色谱法用于硫酸软骨素的分离纯化先于季铵盐沉淀法，并因此而导致了某些新的糖胺聚糖的发现 离子交换树脂可以反复应用，因此大大节省了纯化成本 温和的分离条件避免了对糖链结构的影响 具有从稀溶液（包括组织消化液）中吸附糖胺聚糖的能力，从而适合大体积溶液的浓缩 离子交换法可分为阴离子交换和阳离子交换 与阳离子交换相比，阴离子交换色谱更常用于不同糖胺聚糖之间的分离 由于不同糖胺聚糖的分子结构不同，所携带的负电荷量不同，在阴离子交换树脂上的保留行为不同，因此，可采用不同盐浓度洗脱而得以分离 文献常用的阴离子交换树脂包括Dowex聚苯乙烯树脂、DEAE-纤维素等纤维素类树脂、DEAE-Sephadex、QAE-Sephadex等葡聚糖类树脂，不同树脂各有优劣 Dowex在分离清晰度方面较纤维素类为佳 交联度：交联度高的树脂网眼较小，大分子的糖胺聚糖不易进入树脂内部，因此实际交换量往往较小 交换容量：纤维素类较小，而树脂类或凝胶类较大，前者一般为0.3 ～1.0mmol/g，后者则在2.5 ～3.5mmol/g左右 交换剂上功能基团的解离状态也可能影响交换能力：不同交换剂的最佳交换条件各有不同，一般来说，上柱溶液中加入氯化纳至0.03 ～0.05mol/L可以增加吸附交换量 溶液pH也可能影响交换量 硫酸软骨素粗提消化液中，往往会残留蛋白质及肽等杂质。 实验室中常用三氯乙酸沉淀去除杂蛋白，但不适用于生产 绝大多数氨基酸的等电点均在4.0以上，因此，在pH4.0或以下的溶液中，蛋白质携带正电荷，而硫酸软骨素分子中含有糖醛酸及硫酸酯基，而携带负电荷，因此，采用阳离子交换时，蛋白质被吸附在柱上，而硫酸软骨素则被洗脱 组织粗提液（左）、透析后（中）及阳离子交换