常用地单克隆抗体检测方法.pdfVIP

常用的单克隆抗体检测方法 通过杂交瘤技术制备单克隆抗体，在杂交瘤制备完成 后，需要对抗体进行一个检测，本文介绍了几种常用的抗体 检测的方法（ 1）免疫酶技术免疫酶技术是将抗原抗体反应 的特异性和酶对底物显色反应的高效催化作用有机结合而 成的免疫学技术。由于它特异性强，灵敏度高，现已广泛用 于筛选和鉴定单抗。①器材和试剂 a、包被缓冲液：碳酸盐 缓冲液：取 0.2mol/L Na2CO3 8ml ，0.2mol/L NaHCO3 17ml 混合，再加 75ml 蒸馏水，调 PH 至 9.6 。Tris-HCl 缓冲液 （PH8.0 ， 0.02mol/L ）：取 0.1mol/L Tris 100ml ，0.1mol/L HCl 58.4ml 混 合，加蒸馏水至 1000ml 。b、洗涤缓冲液（ PH7.2 的 PBS）： KH2PO4 0.2g ，KCl 0.2g ，Na2HPO4 ·12H2O 2.9g ，NaCl 8.0g ， Tween-20 0.5ml ，加蒸馏水至 1000ml 。c、稀释液和封闭液： 牛血清白蛋白（ BSA ）0.1g，加洗涤液至 100ml ；或用洗涤 液将小牛血清配成 5-10%使用。 d 、酶反应终止液（ 2mol/L H2SO4 ）：取蒸馏水 178.3ml ，滴加浓硫酸 （98% ）21.7ml 。e、 底物缓冲液（ PH5.0，磷酸盐 -柠檬酸缓冲液） ：取 0.2mol/L Na2HPO4 25.7ml ，0.1ml/L 柠檬酸 24.3ml ，再加 50ml 蒸馏水。 柠檬酸溶液及配成的底物缓冲液不稳定，易形成沉淀，因此 一次不宜配制过多。 f 、底物使用液： OPD 底物使用液（测 490nm 的 OD 值）：OPD 5mg ，底物缓冲液 10ml ，3% H2O2 0.15ml 。TMBS 或 TMB 底物使用液（测 450nm 的 OD 值）： TMBS 或 TMB （1mg/ml ）1.0ml ，底物缓冲液 10ml ，1% H2O2 25ul 。ABTS 底物使用液 （测410nm 的 OD 值）：ABTS 0.5mg ， 底物缓冲液 1ml ，3% H2O2 2ul 。g、抗体对照：以骨髓瘤细 胞培养上清作为阴性对照，以免疫鼠血清作为阳性血清。 h、 抗原： 可溶性抗原：尽量纯化，以获得高特异性。病毒感 染的传代细胞或全菌抗原。淋巴细胞等悬液。 i 、酶标抗鼠抗 体或酶标 SPA 或其他类似试剂。 j 、 细胞固定液： -20 ℃丙酮； 或丙酮 - 甲醛固定液： Na2HPO4 100mg ，KH2PO4 500mg ，蒸 馏水 150ml ，丙酮 225ml ，甲醛 125ml ；或丙酮 - 甲醛溶液 （1； 1）；或-20 ℃甲醇。 k 、聚苯乙烯微孔板： 40 孔、 96 孔、或条 孔；硬板或软板均可使用。 l、酶联免疫阅读仪；或光镜。 m、 吸管、加样器及水浴箱、离心机等。②可溶性抗原的酶联免 疫吸附试验 （ELISA ）a、纯化抗原用包被液稀释至 1-20ug/ml 。 b、以 50-100ul/ 孔量加入酶标板孔中，置