为什么NCCN指南对20外显子插入突变提示可能耐药.docVIP

一个问题　为什么NCCN指南对20外显子插入突变提示 “可能预测临床对TKIs耐药”？ EGFR２０ 外显子插入突变通常认为对TKI耐药，NCCN指南并没有给出一个完全耐药的提示。 下面两个研究会使我们对这一位点有更准确的理解。一项来自2013年发表在《Sci Transl Med》对肺癌中２０外显子 插入突变的结构、生化和临床特征的研究。先来看下２０外显子插入在EGFR结构上的位置，２０外显子在激酶结构域上构成C-螺旋和环，即图1黄色螺旋和后面紫色环状。再直观看下２０外显子不同插入位点所处结构位置，见图1右图所示。 这些不同类型的２０外显子插入位点对TKI药物反应如何呢？研究者分析了19例不同２０外显子插入类型经吉非替尼或厄罗替尼治疗的患者。其中3例携带EGFR A763_Y764insFQEA的患者2例部分缓解，1例稳定，见图2。尽管患者总数少， A763_Y764insFQEA的RR达到了66.6% (2/3)，对比其他C-螺旋上或以外的位点RR为0%(0/16;p=0.0175)，同样A763_Y764insFQEA患者的PFS比其他类型２０外显子插入的也更长（5.5月vs 1.0月），见图3。 图2.不同２０外显子插入位点患者对TKI的疗效：黄色表示部分缓减（PR），蓝色表示疾病稳定（SD），红色表示疾病进展（PD），*表示患者PD但病灶无法测量。右表是每一个患者对TKI的响应情况。 图3. Kaplan-Meier ＰＦＳ曲线分析。 数据分析来自A763_Y764insFQEA 突变的３例 NSCLC对比１６例其他２０外显子的插入。 研究者在患者临床试验前也在体外测试了含不同２０外显子插入突变的细胞系对TKI的敏感性，选取了Ｃ－螺旋内2种A763_Y764insFQEA和Y764_V765insHH，Ｃ－螺旋末端环内的M766_A767insAI, A767_V769dupASV [等同于 V769_D770insASV], D770_N771insNPG, D770_N771insSVD [等同于S768_D770dupSVD] 和 H773_V774insH [等同于P772_H773insH])。细胞成活实验结果显示非典型的A763_Y764insFQEA 和EGFR-delL747_P753insS和 L858R一样 厄罗替尼抑制浓度低于0.1μM (图4)，而其他的EGFR ２０外显子插入类型和L858R-T790M IC50s均超过2 μM 厄罗替尼。 图4．表达EGFR-delL747_P753insS, delL747_P753insS+T790M,A763_Y764insFQEA, Y764_V765insHH, M766_A767insAI, A767_V769dupASV,D770_N771insNPG, D770_N771insSVD, H773_V774insH, L858R and L858R+T790M的 Ba/F3细胞生长抑制剂量依赖实验。表达不同突变类型ＥＧＦＲ的Ba/F3厄罗替尼处理７２小时，分析细胞成活。每个样品重复３次，ＩＣ５０是３次实验的平均值。 研究者又从蛋白晶体结构层面对耐药的２０外显子插入和不典型的A763_Y764insFQEA做了分析，TKI-不敏感的突变以D770_N771insNPG为代表，晶体结构提示这种类型因为插入的残基在C-螺旋末端形成一个“楔子”导致结合ATP的“口袋”不能变化，意味着这种突变活化ＥＧＦＲ但不能增加对ＥＧＦＲ－ＴＫＩ的亲和性，也就对ＴＫＩ不敏感。不典型的A763_Y764insFQEA未能得到晶体结构，通过模型分析提示插入片段使Ｃ－螺旋往Ｎ端迁移，Ｃ－螺旋上重要的Ｅ７６２也恰好被ＦＱＥＡ中的Ｅ替代（图５）。在这个基础上，Ｃ－螺旋的迁移使Ｉ７５９被丙氨酸所替代，Ｉ７５９，Ｌ７４７，Ｌ８５８和Ｌ８６１都是稳定蛋白非活性构型的疏水基团（图６）。L858R 和 L861Q 是敏感突变，Ｌ７４７突变也是。据此推测ＦＱＥＡ插入引起的I759A与L858R 和 L861Q活化ＥＧＦＲ的机制类似，也同样对ＴＫＩ敏感，只是敏感程度有差异。 　　　　　　 图５．Ｃ－螺旋区域野生型和 FQEA插入序列的比对。　　　 插入的FQEA 残基 (黑体)可能迁移Ｃ－螺旋往Ｃ端方向（上面）也可能往Ｎ端方向（下面） ，Ｎ端方向可以保持关键活性位点７６２仍然是谷氨酸，Ｎ端迁移将拉长Ｃ－螺旋前面的环 (β3-αC)。 图６．ＥＧＦＲ非活性构型时ＦＱＥＡ插入的同源模型。疏水基团簇（黄色侧链）对于非活性构型的稳定 是非常重要的，Ｌ８５８Ｒ和Ｌ８６１Ｑ都是该簇的一部分。ＦＱＥＡ插入将导致Ｉ７５９Ａ，还会改变 β3-αC的长度和构象，这区域正是１９外显子缺失的位置。