TUNE L法检测细胞凋亡.docVIP

TUNE L法检测细胞凋亡1??原理TUNEL（terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)-mediated dUTP nick end labeling, 脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法）是通过检测细胞凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况来评价细胞凋亡的有效方法。细胞凋亡中染色体DNA的断裂是个渐进的分阶段的过程，染色体DNA首先在内源性的核酸水解酶的作用下降解为50-300kb的大片段。然后大约30﹪的染色体DNA在Ca sup2; 和Mgsup2; 依赖的核酸内切酶作用下，在核小体单位之间被随机切断，形成180～200bp核小体式DNA片段（核小体式剪切）。由于DNA双链断裂或只要一条链上出现缺口即可产生一系列DNA的3’-OH末端。增加细胞膜通透性 → 脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT Enzyme）和 荧光素（fluorescein）标记的dUTP进入细胞内 → 在TdT的辅助下dUTP与凋亡细胞中断裂DNA的 3’-OH末端结合 → 再用辣根过氧化酶(HRP)标记的抗荧光素抗体与dTUT上的荧光素（fluorescein）特异结合（荧光显微镜观察）→ 最后用辣根过氧化酶底物二氨基联苯胺（DAB）、过氧化氢与HRP发生氧化、环化反应，形成苯乙肼聚合物而呈现棕褐色 → 特异准确地定位正在凋亡的细胞 → 普通显微镜下观察和计数不同视野中TUNEL阳性细胞的比例来判断细胞凋亡发生情况。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3-OH形成，很少能够被染色。适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞爬片、涂片）的凋亡原位检测。还可应用于抗肿瘤药的药效评价，以及通过双色法确定细胞死亡类型和分化阶段。2? ?器材与试剂2.1 器材：光学显微镜及其成像系统、染色缸、湿盒、各种规格的加样器及枪头、镊子、24孔或6孔板、盖玻片、载玻片、1.5ml eppendorf管、平皿、吸管、锡纸、摇床、计时表、荧光显微镜、光镜、MARKER笔、冰盒、恒温箱、加湿器、塑料缸、微波炉等。2.2 试剂2.2.1试剂盒内容：ROCHE（10人份）（1）50μl酶浓缩液（TdT-enzyme solution）10×??蓝色? ?来源：小牛胸腺，大肠杆菌重组（2）550μl标记溶液（label solution）? ?? ?1×? ?紫色，核苷酸混合物??荧光素标记（3）700μl转化剂-POD（converter-pod）??即用型??黄色，抗荧光素抗体，来源于绵羊的Fab片段，与horse-radish peroxidase偶联注意：3个试剂用前-20度保存，解冻后就都不能反复冻融，溶解后只能在4度保存， 1和2在4度放1个月或3放6个月应该没问题（有放3近10个月做的效果还挺好）。1和2绝不能一次配好分装，配好后，哪怕立即冻存下次也不能用了。只能一次融解，按1：9用多少配多少，配好后直到使用时要一直放在冰上，余放4度保存。2.2.2 需准备试剂2.2.2.1 一般试剂：双蒸水、二甲苯、梯度乙醇（100、95、90、80、70％）、中性树胶、盐酸酒精、苏木素染液等。2.2.2.2 黏附细胞、细胞涂片（1）PBS（pH7.4）（2）封闭液：3%过氧化氢-甲醇（新鲜制备）: 20ml中含30%过氧化氢2ml，甲醇18ml（有用0.3%过氧化氢-甲醇的）（3）固定液：4%多聚甲醛-PBS pH7.4 （新鲜制备）：100ml：4g 多聚甲醛溶于PBS 中，定容到100ml，存放在密闭容器中，65度水浴中溶解，4度保存（两周内使用）。（4）渗透液:0.1%Triton X100-0.1%柠檬酸溶液（新鲜制备并4度预冷）:先配10×即1%的柠檬酸钠溶液，然后，配20ml渗透液：水17.98 ml??+ 1%的柠檬酸钠溶液2ml + Triton X-100 20μl。注意：曲拉通比较黏稠，用加样器吸取后加入时，不要接触溶液，以免凝成砣样，使含量不足。加入后剧烈摇晃可溶。（有用0.2% Triton X100）（5）DAB（新鲜制备）2.2.2.3 石蜡包埋组织（1）PBS（pH7.4）（2）无核酸酶的Proteinase K工作液（10-20 μg/ml in 10 mM Tris/HCl, pH 7.4-8）（3）下列3项任选一项：A：渗透液（同上）B：无核酸酶的胃蛋白酶（0.25%-0.5% in HCL，pH2.0）或胰蛋白酶（0.01N HCL）C：0.1M柠檬酸缓冲液，pH6.0，微波修复。（4）DAB（新鲜制备）2.2.2.4阳性对照（1）DNase 1（3000 U/ml– 3 U/ml in