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1、目前常用的转基因方法有哪些,各有何特点?
转化方法
农杆菌法
PEG法
电击法
微针注射法
基因枪法
花粉管通道法
受体材料
完整细胞
原生质体
原生质体
原生质体
完整细胞
卵细胞
宿主范围
有
无
无
无
无
有性繁殖植物
组培条件
简单
复杂
复杂
复杂
简单
无
嵌合体比例
有
无
无
无
多
无
操作复杂性
简单
简单
复杂
复杂
复杂
简单
设备要求
便宜
便宜
昂贵
昂贵
昂贵
便宜
工作效率
高
低
低
低
高
低
单子叶植物应用
少
可行
可行
可行
广泛
广泛
1、农杆菌介导法是目前双子叶植物基因转移的常用方法。
2、PEG法:
3、电击法:此法在动物细胞中应用较早并取得很好效果,现在这一方法已被广泛用于各种单、双子叶植物中,特别是在禾谷类作物中更有发展潜力。
4、微针注射法:显微注射的一个重要问题是必须把受体细胞进行固定。
转化的成功率高
可以省去选择性标记的麻烦
5、基因枪法:是继农杆菌介导法之后的第二大基因转化法。
在禾本科作物上应用较广泛。
基因枪法转化的优缺点:
无宿主限制:农杆菌介导法只对双子叶植物敏感,限制了它的应用范围。而基因枪没有物种限制。
靶受体类型广泛:可以是原生质体,叶片,悬浮细胞,茎或根切段,种子胚,愈伤组织,花粉等。
操作简单快速
但该方法转化率低,外源DNA整合机理不清楚。应该说该技术只处在研究阶段,尚未成熟。
6、花粉管通道法:优点:利用整体植株的卵细胞、受精卵或早期胚细胞转化DNA,无需细胞、原生质体等组织培养和诱导再生植株等一套人工培养过程。方法简便;单、双子叶植物均可应用;育种时间短。
缺点:这一技术局限欲开花时间才能应用;对DNA大小纯度要求高。
2、植物转基因受体材料有哪些?试述选择受体细胞的原则。
原则:
据所用载体体系及受体细胞的基因型进行选择;
重组体的转化或转染率高;
能够稳定遗传;
受体细胞基因型与载体所含的选择标记匹配;
易于筛选重组体;
外源基因可以高效表达和稳定遗传;
此外,安全性、导入方法、翻译及后加工机制和生产应用价值等。
受体材料类型:(1)微生物表达系统(是较为理想的受体细胞)
常用微生物表达系统:大肠杆菌、枯草杆菌、蓝细菌、棒状杆菌和链霉菌、酵母菌
(2)植物表达系统:
常用的受体材料有以下几大类型:愈伤组织再生系统、直接分化再生系统、原生质体再生系统、胚状体再生系统、生殖细胞受体系统
3、重组子的筛选和鉴定方法
一、载体表型选择法
(一)、抗药性标记及其插入失活选择法
1. 原理:pBR322质粒上有两个抗菌素抗性基因: Tetr和Ampr。 Tetr上有插入位点BamH I和Sal I; Ampr上有插入位点Pst I。
2. pBR322抗菌素标记选择
(1)四环素:抑制细菌生长,但不杀死细菌。
(2)氨苄青霉素抗性基因:产生b-内酰胺酶,使氨苄青霉素转变为青霉酮酸,使碘-青霉素指示液(I2-KI-Aampicillin)(蓝灰色)褪色。
(3)环丝氨酸:杀死生长的细菌,但不杀死停止生长的细菌。
3. 选择过程:
(1)四环素抗性插入失活
如果在Tetr上插入外源DNA,导致四环素抗性基因失活,可用四环素加环丝氨酸平板培养基选择重组克隆。
Tetr失活的菌生长被四环素抑制,不被环丝氨酸杀死,保留下来;
Tetr不失活的菌抗四环素,能分裂生长,反而被环丝氨酸杀死。
(2)氨苄青霉素抗性插入失活选择过程
如果Ampr上插入外源DNA,导致氨苄青霉素抗性基因失活,可用碘-青霉素指示液选择。
(二)b-半乳糖苷酶显色反应选择法
1、原理见简答
2、. 选择过程 见简答
二、根据插入基因的表型选择:利用插入的外源基因的表达产物特性进行直接选择。(只在特定条件下)。
(一)原理:
1.弥补缺陷:转化进来的外源基因产物能够弥补受体菌株的突变型缺陷。
2. 增加新性状:使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。
三、DNA电泳检测法 :利用有插入片段的重组载体的分子量比野生型载体分子量大。
(一)直接电泳检测法:从转化后的菌体克隆中分离质粒,电泳、比较其分子量。
(二)酶切电泳筛选法
1. 原理:根据已知的外源DNA序列的限制性酶切图谱,选择一两种内切酶切割质粒,电泳后比较电泳结果(DNA带数和长度)。或用合适的内切酶切下插入片断,再用其它酶切这个片断,电泳后比较结果是否符合预计的结果。
(三)PCR扩增检测法
1. 原理:PCR能在模板序列上扩增出预期DNA片断。
2. 过程:从重组克隆中提取质粒(或DNA),用外源DNA插入片断引物作PCR,电泳PCR产物,检查是否有PCR产物,PCR产物的长度是否与外源基因一致。
(四)核酸杂交检测法
1. Southern blotting :用DNA(或
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