实时荧光定量PCR详细操作步骤.docVIP

实时荧光定量PCR 组织RNA提取： 一般认为100mg肝组织提取RNA 500ng，100mg肺提取RNA 200ng，脑内的RNA丰度适中，100mg脑组织，提取RNA 5-200ng。所以一个10mg的海马可匀出RNA约为20ng。 反转录反应 反转录反应参照TaKaRa RT-PCR说明书。 反转录反应条件如下。 37°C 15 min（反转录反应） 85°C 5 sec（反转录酶的失活反应） Real Time PCR反应 选用脑源神经营养因子（BDNF）为目标基因，核糖体18S rRNA(18S rRNA)做为内参。 基因 引物序列 扩增片段长度 NR2B NR2B(+) CCGCAGCACTATTGAGAACA 213 bp NR2B(–) ATCCATGTGTAGCCGTAGCC 18s rRNA 18s rRNA(+) tttgttggttttcggaactga 198 bp 18s rRNA(–) cgtttatggtcggaactacga 1） 按下列组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）。 试剂 使用量 终浓度 SYBR? Premix Ex TaqTM（2×） 12.5 μl 1× PCR Forward Primer（10 μM） 1 μl 0.4 μM PCR Reverse Primer（10 μM） 1 μl 0.