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流式的原理及应用杜欣康BD生物科学，流式细胞仪技术支持电话箱：Jack_du@BD.com什么是流式细胞术什么是流式细胞术流式细胞术（Flow Cytometry）是指利用流式细胞仪，通过检测细胞上/内特异标记的荧光信号，从而测定细胞的多种生化特性（表面受体、抗原、离子、DNA/RNA等的表达）的方法。流式细胞术的特点流式细胞术的特点分析对象：任何直径50 μm的颗粒，一般为单细胞悬液流式细胞术的特点分析对象：任何直径50 μm的颗粒，一般为单细胞悬液分析速度：快速，Calibur 2,000事件/秒流式细胞术的特点分析对象：任何直径50 μm的颗粒，一般为单细胞悬液分析速度：快速，Calibur 2,000事件/秒检测参数：多个（两个散射光，多个荧光参数）流式细胞术的特点分析对象：任何直径50 μm的颗粒，一般为单细胞悬液分析速度：快速，Calibur 2,000事件/秒检测参数：多个（两个散射光，多个荧光参数）检测结果：精度高，准确性好，具有统计学意义BD公司的分析型流式细胞仪BD公司的分选型流式细胞仪流式细胞仪的结构流式细胞仪的结构液流系统收集细胞并使之与激光正交流式细胞仪的结构液流系统收集细胞并使之与激光正交光学系统激发和收集光信号流式细胞仪的结构液流系统收集细胞并使之与激光正交光学系统激发和收集光信号电子系统把光信号按比例转化成电子信号流式细胞仪的结构液流系统激光正交流动室上样针废液桶鞘液桶流式细胞仪的结构液流低流速高流速红激光蓝激光紫激光鞘液样本鞘液鞘液鞘液样本流式细胞仪的结构流速：低速 12 μl/min中速 35 μl/min高速 60 μl/min流式细胞仪的结构光学系统流式细胞仪的结构长通带通长通+带通接收器流式细胞仪的结构流式细胞仪的结构 Laser Wavelength Min. Power Commonly Used Fluorochromes (nm) (mW) or Dyes Blue 488 nm 13 FITC, PerCP, PerCP-Cy5.5 Red 633 nm 11 APC, APC-Cy7, APC-H7 Violet 405 nm 30 Pacific Blue?, DAPI, BD Horizon V450 and V500 Near UV 375 nm 7 Hoechst Red, Hoechst Blue, PI, DAPI Yellow-Green 561 nm 30 PE, PE-Cy5.5, PE-Cy5, PE-Texas Red?, mCherry, PE-Cy7, PI Blue-Violet 445 nm 20 CFP, AmCyan fluorescent protein流式细胞仪的结构流式细胞仪的结构电子系统光子光信号转化为电信号电信号处理接收器电脑流式细胞仪的结构电子系统流式细胞仪的结构 高（H）=最大荧光强度 宽（W）=时间 面积（A）= 总荧光强度流式细胞仪的结构流式细胞仪的结构流式细胞仪的结构流式细胞仪的结构流式细胞仪的结构流式细胞仪操作的基本流程流式细胞仪操作的基本流程样本收集数据分析开机和液流启动清洗和关机质控样本收集数据分析流式分析样本的制备流式分析样本的制备流式分析样本的制备单细胞悬液的制备目的分子的标记样本过滤等待上机流式分析样本的制备流式分析样本的制备流式分析样本的制备流式分析样本的制备流式分析样本的制备流式分析样本的制备流式分析样本的制备流式常见的实验流式常见的实验荧光免疫直接染色 vs 间接染色强荧光配弱表达，强表达配弱荧光染料数量不大时可以避免使用临近通道通道间的溢漏（补偿）流式常见的实验荧光免疫强荧光配弱表达强表达配弱荧光流式常见的实验荧光免疫什么是溢光？为什么要补偿？流式常见的实验流式常见的实验荧光免疫为什么要做同型对照和单阳管？流式常见的实验荧光免疫（实例）CD4 FITC, CD8 PE, CD3 APC 染色同型对照：PB 100μL +Isotope FITC 20μL+ Isotope PE 20μL+ Isotope APC 5μL 单阳管：PB 100μL +CD4 FITC 20μL+ Isotope PE 20μL+ Isotope APC 5μL 单阳管：PB 100μL +Isotope FITC 20μL+CD8 PE 20μL+ Isotope APC 5μL 单阳管：PB 100μL +Isotope FITC 20μL+ Isotope PE 20μL+CD3 APC 5μL 样品管：PB 100μL +CD4 FITC 20μL+CD8 PE 20μL+CD3 APC 5μL 流式常见的实验流式常见的实验细胞周期流式常见的实验