ctDNA检测技术-（最新版-已修订）.pdf

ctDNA 检测技术 循环肿瘤 DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)来源于肿瘤细胞的凋亡、坏死 或分泌产生的 DNA 片段，是循环游 DNA(circulating cell-free DNA,cfDNA) 的一 [1] 部分 。ctDNA 含有与其来源肿瘤 DNA 同样的基因缺陷，如点突变，重排，扩 [2] [3] 增等 ；其在血液中的半衰期短，可实时反映肿瘤的动态变化 ;作为液体活检的 [4] 一种，可克服组织活检中由于肿瘤异质性带来的缺陷，检测更全面 ,因此 ctDNA 的检测可用于癌症早期诊断与癌症分期、肿瘤的疗效评估、复发监测和预后判断 [5] 等 。由 ctDNA 的质量和数量变化大, 因此需要高特异性和高灵敏度的检测方 法。目前常用的方法有数字 PCR (digital PCR, dPCR) 、BEAMing (bead, emulsion,amplification and magnetic)、高通量测序(next generation sequencing, [6] NGS) 、ARMS 等 。 1.数字 PCR [7] 1999 年 Vogelstein 等提出了数字 PCR(digtal PCR,dPCR) 的概念 。数字PCR 包 括两部分，即 PCR 扩增和荧光信号分析。先将是样品稀释后分配到大量微小的 反应单元中，每个单元包含或不包含一个或多个拷贝的目标分子,然后分别对目 标分子进行扩增，扩增结束后对每个反应单元的荧光信号进行采集。数字 PCR 采用直接计数的方法进行定量分析, 有荧光信号的反应单元中至少包含一个拷 贝的目标分子，记为 1，无荧光信号的则即为 0 ，理论上，在样品中极限稀释的 情况下，有荧光信号的反应单元数目等于目标 DNA 分子的拷贝数。但是有的反 应单元中可能包含两个或两个以上的目标分子，这时需要用泊松概率分布公式进 [8] 行计算 。不同于传统的 qPCR 技术,数字 PCR 不受扩增曲线的循环阈值(C ) T [9] 和扩增效率的影响，无需参照，准确性和重复性好，可实现绝对定量分析 。 根据反应单元类型不同，数字 PCR 分为三类: 微反应室/ 孔板数字 PCR 、微流 控芯片和微滴数字 PCR 系统。微反应室/孔板数字 PCR 借助高通量自动上样设备 和增加的反应单元数,实现快速精确取样，提高检测灵敏度。微流控芯片技术是 一种基于含有数千个超高密度亲疏水微孔芯片的 dPCR 平台，可实现高通量、低 成本分析。微滴数字 PC Ｒ( droplet digital PC Ｒ,ddPCR)是将含有目标分子的样品 分成成千上万个纳升级的油包水微滴，再对每个微滴进行扩增，和荧光信号的采 集，更容易实现小体积和高通量[10] 。 数字 PCR 可绝对定量，是目前灵敏度最高的检测技术，但其也存在一定缺点， 如生成的微滴必须服从泊松分布，所以不适合高浓度 DNA 样本检测，；只能检 测已知的突变且一次只能检测一种突变[11,12] 。 2.BEAMing 技术 BEAMing 技术在检测 ctDNA 内体肿瘤突变具有非常高的灵敏度，它是结合了 数字 PCR 以及流式技术的一种检测方法，最早是由Bert Vogelstein 提出。其方 法是每一类 DNA 分子都会