磷酸酶活性测定.docxVIP

磷循环：碱性、酸性磷酸酶（对硝基苯磷酸二钠比色法）参考：《Methods of Soil Enzymology》Dick R P. Methods of Soil Enzymology[M]. Madison: Soil Science Societyof America, 2011: 163–168 一 原理 该方法以对硝基苯磷酸二钠（即pNPP）为基质，基质在土壤酸性磷酸酶的催化下水解生成黄色色的对硝基苯酚（即pNP），该黄色溶液在420nm处有最大吸收光值，根据对硝基苯酚的生成数量与黄色溶液的吸光度呈正比来进行定量分析，以此来反映土壤酸性磷酸酶的活性。 二 试剂： 修正通用缓冲液【Modified universal buffer (MUB)】：溶解 12.1 g 三羟甲基氨基甲烷tris(hydroxymethyl)aminomethane, 11.6 g 顺丁烯二酸（马来酸）maleic acid, 14.0 g 柠檬酸citric acid，6.3 g 硼酸boric acid于488 ml氢氧化钠溶液[C（NaOH）＝1 mol﹒L－1]中，然后用水定容到1 L ，储存于4度。 0.1 mol﹒L－1盐酸：4.2mL浓盐酸加水稀释至500mL. 1mol/L NaOH：40g NaOH溶于1L去离子水中. 酸性磷酸酶（pH 6.5缓冲溶液）：取200 ml通用缓冲液至1000 ml烧杯中，用盐酸（0.1 mol﹒L－1）溶液调至pH 6.5，用水定容。 碱性磷酸酶（pH 11缓冲溶液）：取200ml通用缓冲液于1000 ml烧杯中，用氢氧化钠（0.1 mol﹒L－1）溶液调至pH11，用水定容。. 对硝基苯磷酸二钠溶液（0.05 mol﹒L－1）：称取0.9303 g六水对硝基苯磷酸二钠溶于40 ml PH 6.5或者11的缓冲溶液，用同一种缓冲溶液稀释至50 ml，低温贮存。 0.5mol/LCaCl2溶液：73.5g CaCl2溶于少量去离子水中，并稀释至1L。 0.5mol/L NaOH：20g NaOH溶于1L去离子水中。 对-硝基酚标准溶液：1g对-硝基酚溶于少量去离子水中，并稀释定容至1L，溶液保存在暗色瓶中于4℃下保存。使用时取1mL该溶液稀释至100mL (lmL含10μg酚)。 甲苯；去离子水 三 仪器：酶标仪；酶标板；培养箱；10ml离心管*200；50/100ml容量瓶；恒温水浴 四 操作步骤 ①取0.5g新鲜土壤(2mm)于10ml离心管中，加入0.1 mL甲苯和2 mL pH6.5 磷酸缓冲液，再加0.5 mL 0.05 mol/L对硝基苯磷酸二钠溶液 （用磷酸缓冲液配制），摇匀后加盖，放进36~37℃的培养箱中进行培养1个小时； ②培养完成后取出加入0.5 mol/L的CaCl2 0.5 mL 及0.5 mol/L的NaOH 2 mL，摇匀后迅速过滤，于420nm处比色。； ③ 对每一土样，设置用0.5mL水代替苯磷酸二钠基质的对照。（无基质对照） ④同时做空白对照，加对-硝基酚磷酸钠溶液之前加入CaCl2溶液和NaOH溶液，并迅速过滤。 标准曲线的制作 分别取该稀释液0，1，2，3，4和5ml于50ml三角瓶中，用去离子水调节溶液体积至5ml，然后加入1.00ml0.5M CaCl2溶液和4.00ml 0.5M NaOH溶液，充分混匀后迅速过滤，同上比色测定。标曲对应的酚含量依次为0、2、4、6、8、10μg/mL 以吸光值为横坐标、对硝基苯酚的含量为纵坐标计算直线回归方程y=a+bx及相关系数R，即对硝基苯酚含量C（μg/mL）=a+b×A420。其中，x为以供试样品所得消光值减去对照样品消光值的差。 五 计算方法 土壤酸性磷酸酶的活性用每克土中的对硝基苯酚的微克数表示， 土壤磷酸酶活性(μg对-硝基酚/g·h) = CV/(dwt×t) 其中，C为样品中对-硝基酚含量(μg/ml)；V为土壤溶液体积(ml)；dwt为烘干土壤质量(g)；t为反应时间(h)。