现代分子诊断技术2（可修改）.ppt

︵。︵ 利用核酸双链的碱基互补、变性和复性的原理，可以用已知碱基序列的单链核酸片段作为探针，与待测样本中的单链核酸互补配对，以判断有无互补的同源核酸序列的存在 核酸探针 是指带有标记的某一特定DNA或RNA片断，能与待测样本中单链核酸分子互补配对结合，进而检测同源序列 探针标记物 有放射性核素或非放射性核素（生物素、地高辛、荧光素等）两大类 ︵。︵ * 分离杂交探针的方法： 提取某一病原微生物株系的染色体DNA 限制性内切酶进行酶解 得到的酶解片段克隆进一质粒载体，构建质粒文库 文库中重组质粒的插入片段即可用来分别同病原性微生物和非病原性微生物的核DNA进行杂交、筛选 ︵。︵ * 核酸杂交的灵敏度和可靠性极高 用探针直接同粪便样品、尿样、血样、喉洗液和组织样品中的目标DNA进行杂交，且无需预先纯化DNA 若样品中的目标分子非常少，则需通过PCR将目的序列扩增，再进行杂交检测 从理论上讲，用DNA杂交来诊断疾病可用于对所有的致病微生物的检测 ︵。︵ * 4、非同位素标记探针 32P的缺点： ⑴半衰期短，仅13天 ⑵操作起来比较危险 ⑶必须要有特殊的实验室设备进行操作 ⑷放射性垃圾的处理繁琐 ︵。︵ * 非放射性杂交检测系统： 通过酶促反应将某种底物转变成生色物质或化学发光物质而达到放大信号的目的 采用将生物素（biotin）标记的核苷酸掺入DNA的方法制备探针 生物素标记的DNA在室温下至少可保存一年 检测发光和颜色变化可在几小时内完成 ︵。︵ * B B B B AP B B AP 生物素 加入链霉素抗生物蛋白 加入生物素标记的碱性磷酸酶 探针 目的DNA 加入不同的生色或化学发光底物 ︵。︵ * 荧光标记的引物直接进行PCR检测 DNA 引物1 引物2 荧光染料 PCR 层析 荧光检测 游离引物 ︵。︵ * 分子夹心探针检测 发出荧光 分子夹心探针(没有荧光) 荧光团 猝灭剂 目的DNA 与目的DNA杂交 ︵。︵ * TaqMan探针技术 原理： 利用Taq酶的3′ 5′外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号，由于探针与模板特异性结合，荧光的强弱就代表了模板的数量 ︵。︵ * 3′ 5′ 5′ 3′ Q R 上游引物 下游引物 5 ′ 3′ 3′ 5 ′ Q R TaqMan探针的荧光信号产生机制 ︵。︵ * 疟疾的分子诊断： 检测是否存在疟原虫 抽取血样进行镜检 免疫诊断:ELISA检测疟原虫蛋白或抗体 无法区分是以前感染还是现在感染 DNA杂交诊断 例一： ︵。︵ * DNA的杂交探针是一段疟原虫的高度重复的DNA序列 具体的分离过程： 构建一个疟原虫的核基因文库 用标记的疟原虫核DNA作探针去筛选核基因文库 选出那些杂交信号最强的克隆 用这些选出来的片段作探针，与疟原虫及其同属中不导致疟疾的种的核基因作杂交，以检查该片段作为DNA探针的可靠性 ︵。︵ * 锥虫的检测 锥虫在人体中可侵入肝、脾、淋巴结、中枢神经系统，在其中大量繁殖并杀死寄主细胞 显微镜检新鲜血液 取新鲜血液感染未携带锥虫的寄生虫,30-40天后杀死昆虫,镜检昆虫的肠道 免疫检测:假阳性高 例二： ︵。︵ * PCR检测 针对锥虫特有的一段188bp的DNA序列设计引物，特异地从锥虫基因组中扩增得到188bp的条带 ︵。︵ * 二、细菌性传染病及病毒性疾病的分子诊断技术 抗生素的不合理使用 DNA杂交 PCR检测 噬菌体介导 ︵。︵ * DNA杂交 设计16SrRNA为探针 16SrRNA在细菌中拷贝数极高，高度的保守性 特异性不是很好 必须结合PCR技术 ︵。︵ * PCR检测 nested PCR 针对目的病原菌的不同保守区段设计多对引物 每对引物都能特异的扩增出一段目的片段，病原菌存在的可能性大大增加 ︵。︵ * 模板 使用外引物，进行第一次PCR扩增 使用内引物，进行第二次PCR扩增 第一次PCR扩增产物 第二次PCR扩增产物 巢式PCR原理示意图 ︵。︵ * PCR技术也会产生假阳性 新扩增的目的DNA特异性不强 退火温度过低 模板中杂质的污染 假阴性 存在Taq酶的抑制剂 模板量过少 模板DNA纯度不够 ︵。︵ * 原位PCR(in situ PCR,ISPCR ) 在细胞或细胞切片上对待测的低拷贝数基因进行扩增，并通过原位杂交进行检测 不仅能检测出病原微生物的存在，且能够在组织细胞中定位 ︵。︵ * 原位杂交（nucleic acid hybridization in situ） 将标记探针与细胞或组织切片中的核酸进行