PCR实验报告（整理）（一）.pdf

PCR 实验报告 7 月19 日 高遄 实验目的：了解PCR 技术原理，掌握最基础的PCR 实验步骤。 实验试剂：模板DNA，Mg2+，buffer，dNTPs，Taq DNA 聚合酶，引物，H2O，石蜡油。 实验原理： ⚫ PCR 全称聚合酶链反应，是体外快速扩增特定基因或DNA 序列最常用的方法。 ⚫ 基本原理：首先将双链DNA 分子在临近沸点的温度下加热分离成2 条单链DNA 分子， DNA 聚合酶以单链DNA 为模板并利用反应混合物中的四种脱氧核苷三磷酸合成新的DNA 互 补链。PCR 反应时，只要在试管内加入模板DNA、PCR 引物、四种核苷酸及适当浓度的Mg2+， DNA 聚合酶就能在数小时内将目标序列扩增100 万倍以上。 （1）双链模板DNA 分子首先在高温下解开成长的单链，短链引物分子立即与该模板DNA 两端的特定序列相结合，产生双链区。 （2 ）DNA 聚合酶从引物处开始复制其互补链，迅速产生与目标序列完全相同的复制品。 （3 ）在后续反应中，无论是起始模板DNA 还是经复制的杂合DNA 双链，都会在高温下解 开成为单链，体系中的引物分子再次与其互补序列相结合，聚合酶也再度复制模板 DNA。 （4 ）由于在PCR 反应中选用的一对引物，是按照与扩增区域两端序列彼此互补的原则设计 的，因此每一条新生链的合成都是从引物的退火结合位点开始并朝反方向延伸的，每 一条新合成的DNA 链上都有新的引物结合位点。 （5 ）整个PCR 的反应全过程，即DNA 解链（变性）、引物与模板DNA 结合（退火）、DNA 合成（链的延伸）三步可以被不断重复。经多次循环之后，反应混合物中所含有的双 链DNA 分子数，即两条引物结合位点之间的DNA 区段的拷贝数，理论上的最高值应 该是2^n，能进一步满足遗传分析的需要。 ⚫ 试剂作用： （1） 引物：DNA 复制的起始点，针对复制DNA 片段的两端，有5’引物和3’引物 （2 ） Taq DNA 聚合酶：促进dNTPs 与模板结合。 （3 ） Buffer：Tris-HCl 反应缓冲液，Taq DNA 聚合酶提供一个最适酶催反应条件。 （4 ） Mg2+：对PCR 扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR 扩增的特异性，浓度过低则 影响PCR 扩增产量甚至使PCR 扩增失败而不出扩增条带。 （5 ） dNTPs：底物，在引物引导下合成与模板互补的DNA 新链。 （6 ） 石蜡油：防止PCR 加热过程中DNA 蒸发。 ⚫ 试剂配置体积： 20 μl 体系中各试剂配置如下表： 试剂 H2O Buffer Mg2+ dNTPs P （引物）T （模板）E （酶） 体积/ μl 9 2 2 4 2 1 0.4 ⚫ 温度和时间： （1） 热启动：94℃，5~10min （2 ） 变性：94 ℃，45~60s 。 （3 ） 退火：50~65℃，1min。退火温度计算：Tm- （5℃~10 ℃），Tm （解链温度）=4 （G+C ） +2 （A+T ）。 （4 ） 延伸：72℃，1~1.5min 。 （5 ） 步骤（2 ）~ （4 ）热循环25~30 个周期 （6 ） 保温：延伸72℃，10min ⚫ 产物检测：凝胶电泳。 1 实验步骤： （1）设计20 μl 体系各试剂配比： 试剂 H2O Buffer Mg2+ dNTPs P （引物）T （模板）E （酶） 体积/ μl 9 2 2 4 2 1 0.4 （2 ）按照预先设计的20 μl 体积配置6 管试管量，实际加入量如下表 试剂 H2O Buffer Mg2+ dNTPs P （引物）T （模板）E （酶） 6x 加入 54 12 12 暂不加入 12