细胞冻存与复苏应用方向发展历史和冷冻技术.docx

细胞冻存与复苏应用方向、发展历史和冷冻技术 概述 细胞培养技术自 1907 年开创以来， 历经一个世纪现已成为自然科学领域不可缺少的研究方 法之一。 在细胞培养技术广泛用于科学研究领域的令天， 细胞株的冷冻保存和解冻复苏这一 基础技术日益得到重视。 低温保存是活体组织保存最常用的方法之一。冷冻保存一般是指在 0～ 196 ℃进行保存，就 是将体外培养物悬浮在加有或不加冷冻保护剂的溶液中， 以一定的冷冻速率降至零下某一温 度，并在此温度下对其长期保存的过程。主要有 -20 ～40 ℃ 冰箱保存、 -60 ～ 80℃深 低温冰 箱和液氮（ -196 ℃）超低温保存等。 应用方向 1. 医学方面 近年来干细胞的研究越来越被人们关注， 由于它是一种具有自我复制能力的多潜能细胞， 在 一定条件下，可分化为多种功能细胞。 根据发育阶段和取材来源， 干细胞分为胚胎干细胞和成体干细胞两大类。 骨髓和脐血是成体 干细胞的主要来源。 骨髓干细胞在骨髓中含量极少， 约占骨髓有核细胞的十万分之一， 所以要在临床上广泛应用 首先必须具备先进的冻存与复苏技术。 而干细胞研究的深入将解决包括癌症等一系列为人们所知的 “绝症 ”。而 “冬眠 ”技术对医学的 发展有着里程碑式的意义。 生物学方面 细胞冻存技术是生物学保存物种的重要手段。 在环境遭到史无前例的破坏动物、 植被随时可 能面临灭绝危险的今天， 更是尤为关键， 虽然不是治本的方法， 但至少可以尽可能的留下那 些曾经存在的生命痕迹。 发展历史 1776 年， Spallanzani 最早发表了 “冷”处理对 “细胞 ”生命活动影响的报道。 十九世纪中后叶，许多早期的工作者（Prevost ， 1840 ； de Quatrefages ，1853 ； Mant egazza ， 1866 ； Scheuk ， 1870 ）重复研究了低温处理对精子活动的影响，得出了和 Spal lanzani 相似的结论。即 “冷不能杀死精子 ”。 1900 年前后，科学家基本上肯定了生物成份能够在零下温度储存的事实。 二十世纪 50 年代， Luyet 等多位学者发现了电解质浓度对储存细胞的损伤作用，他们的基本结论是。电解质浓度增大是造成储存细胞损伤的主要原因。 5. 1972 年，Mazur 等首先根据中国仓鼠组织培养细胞的低温保存实验数据分析， 提出关于 冷冻损伤的两因素假说目，即冰晶损伤和溶液损伤假说。 这个假说认为随着温度的下降， 细胞内外的水分结冰， 所形成的冰晶会造成细胞膜和细胞器 的破坏并引起细胞死亡。这种因细胞内部结冰而致的细胞损伤即就是冰晶损伤（ Intracellul ar ice damage ）。冰晶损伤是由冷却速度过快造成，冷却速度越快，冰晶损伤越大。 同时随着温度的下降， 细胞外部的水分会先结冰， 从而使得未结冰的溶液中电解质浓度升高， 细胞膜上的脂质会因长时问暴露在高溶质的溶液中而受到损坏， 细胞发生渗漏， 导致在复温 时大量水分渗入细胞内造成细胞死亡。 这种因保存溶液溶质浓度增高而致的细胞损伤被称为 溶液损伤（ Solution damage ）。溶液损伤是由冷却速度过慢，使细胞在高浓度的溶液中暴 露的时间过长而造成，冷却速度越慢，此损伤越严重。 主要技术 冻存技术 1. 液氮法 目前，细胞冻存最常用的技术是液氮冷冻保存法， 主要采用加适量保护剂的缓慢冷冻法冻存 细胞。 细胞冷冻技术的关键是尽可能地减少细胞内水分， 减少细胞内冰晶的形成。 采用甘油 或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可以使冰点下降， 提高细胞膜对水的通透性， 且对细胞无明显毒性。 慢速冷冻方法又可使细胞内的水分渗出细 胞外，减少胞内形成冰结晶的机会，从而减少冰晶对细胞的损伤。 常用的细胞冷冻贮存器为液氮贮存器，规格有 35L3 和 50L3 两种。 细胞冻存时常备的材料有： 0.25% 胰蛋白酶 ，含 10% ～ 20% 的血清 培养液， DMSO （分析 纯）或无色新鲜甘油（ 121 ℃蒸气高压消毒）， 2ml 安瓿（或专用细胞 冻存管 ）、吸管、离 心管 、喷灯、纱布袋（或 冻存管 架）等。 主要操作步骤为： （1 ）选择处于对数生长期的细胞，在冻存前一天最好换液。将多个 培养瓶 中的细胞培养液去掉，用 0.25% 胰蛋白酶 消化。适时去掉胰蛋白酶，加入少量新培养液。用 吸管 吸取培养 液反复吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的细胞悬液。悬浮生产细胞则不要消化处理。 然后将细胞收集于 离心管 中离心（ 1000r/min ， 10 分钟）。 （2 ）去上清液，加入含 20% 小牛 血清 的完全培养基，于 4℃预冷 15 分钟后，逐滴加入已 无菌的 DMS