防腐剂合成工艺说明.docVIP

防腐剂合成工艺介绍 主要作为食品防腐剂使用,也应用在生物材料和药物载体领域。ε-PL在日本早已形成了工业化生产,而我国这方面的研究起步较晚。因此,选育ε-PL高产菌株并优化发酵工艺以提高ε-PL发酵水平,对我国实现ε-PL工业化生产提供技术支撑具有重要意义。本论文以白色链霉菌(Streptomyces albulus)FQ-23作为出发菌株,采用硫酸二乙酯(DES)诱变结合抗性筛选,并优化诱变菌株的发酵培养基;通过利用摇瓶补料实验,探究ε-PL合成的最佳补料成分,并测定其关键酶活性;在菌体生长阶段,利用5L发酵罐探究了最佳的pH调控工艺,同时考察了流加不同有机氮源ε-PL产量之间的差异,具体研究内容如下:(1)通过DES化学诱变并结合甘氨酸(Gly)、L-赖氨酸(L-Lys)、磺胺胍(SG)抗性筛选,得到一株诱变菌株FQF-3,ε-PL产量为0.976g/L,与出发菌株相比,其产量提高了8.93%。(2)通过对有机氮源的筛选,选择玉米浆和鱼粉作为ε-PL发酵的混合有机氮源,利用单因素实验,确定了碳氮源的最佳浓度。利用Central Composite中心组合设计(CCD),通过响应面优化其发酵培养基,得出优化模型: Y=1.370-0.006A-0.004B-0.010C+0.027D-0.006AB+0.005AC-0.004AD+0.010BC+0.009BD-0.007CD-0.083A2-0.087B2-0.081C2-0.110D2,优化后的培养基为(g/L):葡萄糖49.70,(NH_4)_2SO_4 9.95,玉米浆7.79,鱼粉12.52,KH_2PO_4·12H_2O 1.36,MgSO_4·7H_2O0.5,K_2HPO_4·3H_2O 0.8,FeSO_4·7H_2O 0.03,ZnSO_4·7H_2O 0.04,此时ε-PL产量最大值为1.373g/L,比优化之前提高了40.7%。(3)通过摇瓶补料实验,研究了补料成分不同对ε-PL合成的影响,同时补葡萄糖及硫酸铵与酵母粉混合液的效果最好,ε-PL最高产量达1.75 g/L。在此基础之上,把有机氮源变成鱼粉产量有所提高,ε-PL最高产量为1.89 g/L。为了改善补鱼粉在菌体浓度方面的不足,采用玉米浆与鱼粉复配,结果显示,玉米浆与鱼粉的浓度比为1:2时,ε-PL最高产量为2.13 g/L,在补鱼粉的基础上提高了13%。测定了补有机氮源后天冬氨酸激酶(ASK)及ε-合成酶(Pls)的活性,补混合有机氮源和补鱼粉的ASK酶活性相当,都比补酵母粉的高;补混合有机氮源的Pls活性在补这几种有机氮源中时最高的,分别是补酵母粉的2.7倍和补鱼粉的1.2倍,验证了补混合有机氮源的效果是最好的。(4)研究了在菌体生长阶段,当初始pH 6.8分别自然下降到6.5、6.0、5.5、5.0时,用12.5%的氨水溶液维持12h,最终确定pH维持在5.0最有利于菌体的生长及ε-PL的累积。在此基础上,研究了当初始pH下降到5.0时,分别用氨水维持6h、12h、18h,结果证实了pH 5.0维持12h的效果最好,ε-PL最高产量为2.81g/L,最高菌体浓度为16.96g/L。(5)基于上述pH调控下,在间歇流加葡萄糖的同时,分别间歇流加硫酸铵与酵母粉、鱼粉、玉米浆、牛肉膏4种不同有机氮源的混合液,流加鱼粉的产量最高,达29.30g/L,与酵母粉相比,产量提高了10%。在此基础之上,流加玉米浆和鱼粉浓度之比为1:2的混合有机氮源,此时最大产量为34.19g/L,在鱼粉的基础上,产量又提高了17%。(6)结合pH调控策略,连续流加补充全料,最终菌体浓度达到53.78g/L,最大产量为37.58g/L