微生物检测菌落总数测定方法.docx

微生物学检验菌落总数的测定 原理 微生物活体数量的测定方法， 常用平板培养计数法。 它是通过将样品制成均匀的一系列不同稀释度的稀释液，再取一定的稀释液接种，使其均匀分布于培养皿中特定的培养基内， 最后根据在平板上长出的菌落数计算出每克（或 mL）样品中的活菌数量。 材料和仪器 2.1 平皿： φ 90mm。 2.2 无菌锥形瓶：容量 250mL ， 500 mL 。 2.3 无菌吸管： 1mL （具 0.01mL 个度） ,10mL （具 0.1mL 刻度）或微量移液器及吸头。 2.4 灭菌锅。 2.5 恒温培养箱 2.6 涂棒。 2.7 酒精灯。 2.8 超净工作台。 2.9 磁力搅拌器。 2.10 漩涡振荡器 检验程序 菌落总数的检验程序见下图。 检样 10g 样品 +90mL 无菌生理水，均质 倍系列稀释 选择至少 3 个适宜样品稀释均液 方法①↙ ↘方法② 各取 1mL 分别加入无菌培养皿中，每皿中加入 15mL~20mL 平板计数琼脂培养基，混匀，凝固。  在培养皿中加入 15mL~20mL 平板计数琼脂培养基，凝固。然后在每皿中加入 0.2mL 样品稀释液，涂布均匀。 ↘ ↙ 36℃± 1℃倒置培养 24～ 48 小时 计算各平板菌落数 计算菌落总数 操作步骤 4.1 培养基和试剂的配制 4.1.1 平板计数琼脂培养基： LB 培养基（最常用） 牛肉膏 5g 蛋白胨 10g 氯化钠 5g 琼脂 20g 蒸馏水 1L pH 7.0～ 7.2 将上述成分加于蒸馏水中，煮沸溶解，调节 pH 值，分装锥形瓶中， 121℃高压灭菌 30 分钟。 4.1.2 无菌生理盐水的配制 ： 称取 8.5g 氯化钠溶解于 1000mL 蒸馏水中， 121℃高压灭菌 30 分钟。 4.2 样品的稀释： 4.2.1 固体样品： 称取 10g 固体样品置于盛有 90mL 无菌生理盐水的无菌锥形瓶中（内装 数粒无菌玻璃珠） ，在旋转式摇床上 200r/min 充分振荡 30min ，制成 1： 10 的样品均 液，即 10-1 稀释液。 4.2.2 用 1mL 无菌吸管或微量移液器吸取 1： 10 样品均液 1mL （吸取前需要摇匀 1：10 稀 释液），缓慢加入盛有 9mL 无菌生理盐水的无菌试管中 （注意吸管或吸头尖端不能触 及 稀释液面），用漩涡振荡器振荡，混合均匀，制成 1： 100 的样品稀释均液。 4.2.3 按照 4.2.2 操作程序，制备 10 倍系列样品稀释液，每递增稀释一次，换用一次 1mL 无菌吸管或吸头。 4.2.4 根据对样品活菌数量的估计，选择 3~4 个适宜稀释度的样品均液（比如 10-6， 10-7， 10-8 ， 10-9 稀释液）。 4.2 平板接种与培养 接种方法 1： 用 1mL 无菌吸管或微量移液器分别吸取不同稀释度的菌悬液 1mL 于一个无菌培养皿中 （每个稀释度做三个重复） ，再在培养皿中分别倒入 10～15mL 已融化并冷却至 45~50℃的 培养基，盖好平皿盖子， 趁热轻轻转动培养皿，使菌液与培养基充分混合均匀，冷凝后在恒 温培养箱中倒置培养 24～２８ｈ，培养温度为 36℃± 1℃。同时以无菌水作空白对照。 注：比如 1000 亿 CFU 样品稀释梯度可选择为： 10-8， 10-9， 10-10。 接种方法 2： 1mL 无菌吸管或微量移液器吸取 0.2ｍＬ稀释液均液于计数培养基平板上，将稀释液涂布均匀， 吸附，在恒温培养箱中倒置培养 24～２８ｈ， 培养温度为 36℃± 1℃。同时以无菌水作空白对照。 （计算时需要把 0.2mL 的倍数也计算在稀释倍数内） 注：比如 1000 亿 CFU 样品稀释梯度可选择为： 10-7， 10-8， 10-9。 ４ .3 菌落计数 可用肉眼观察， 必要时借用放大镜或菌落计数器， 以防遗漏。 记录稀释倍数和相应的菌 落数量。菌落计数以菌落形成单位（ colony-forming units,CFU ）表示 4.3.1 选取菌落数在 30~300 之间，无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。 低于 30CFU 的平 板记录具体菌落数， 大于 300 的可记录为多不可计。 每个稀释度的菌落数应采用 3 个平行平 板的平均数。 4.3.2 其中一个平板有较大片状菌落生长时， 则不宜采用， 而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数； 若片状菌落不到平板的一半， 而其余一半菌落分布又很均匀时， 即可计算半个平板后乘以 2，代表一个平板菌落数。 4.3.3 当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。 4.3.4 若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效，需重新测定。 菌落总数