基因工程复习总结学习资料.docVIP

实用 第一章 绪 论 基因工程（ genetic engineering） 按照人们预先设计的蓝图，将一种生物的遗传物质绕过有性生殖导入另一种生 物中去，使其获得新的遗传性状，形成新的生物类型的基因操作（ genetic manipulation ）。 基因工程诞生的基础理论上的三大发现 ： DNA 是遗传物质 、 DNA 双螺旋模型和半保留复制机理、遗传密码的破译和遗传信息传递方式的确定。 技术上的三大发明： 限制性核酸内切酶的发现与 DNA 的切割 、 DNA 连接酶的发现与 DNA 片段的连接 、基因工程载体的研究和应用 基因工程研究的主要内容基础研究： 基础研究、克隆载体研究 、受体系统的研究、目的基因的研究、生物基因组学的研究、应用研究 基因工程的基本操作程序 分离获得目的基因 ? 限制性核酸内切酶将切割源 DNA 和载体 ? DNA 连接酶将外源 DNA 和载体连接，组成重组 DNA 分子。 将重组 DNA 分子引入受体细胞 带有重组体的细胞培养扩增，获得大量的细胞繁殖群体 筛选和鉴定转化细胞 进一步研究分析，实现功能蛋白的表达 第二章 工具酶 根据工具酶催化的反应类型分为四大类： ①核酸酶，用于切割或降解核酸分子：②连接酶，可以把核酸分子连接起 来：③聚合酶，用于核酸分子的扩增或拷贝：④修饰酶，能够给核酸分子添增或除去核甘酸或某些化学基团。 常用基因工程工具酶：限制性内切酶、甲基化酶 、 DNA 连接酶 、DNA 聚合酶 、 RNA 聚合酶 、磷酸激酶和磷 酸酶 、核酸酶 、核酶。 文档 实用 一、限制性内切酶 1.R-M 系统 ：细菌中存在位点特异性限制酶和特异性甲基化酶，构成了寄主控制的限制 —修饰系统 (R-M Restriction-modification system) 。细菌 R-M 系统的限制酶可以降解 DNA ，为避免自身 DNA 的降解，细菌可以 修饰（甲基化酶）自身 DNA ，未被修饰的外来 DNA 则会被降解。 2. 限制性核酸内切酶（限制酶） ：在细胞内能够识别双链 DNA 分子中的特定核苷酸序列，并对 DNA 分子进行切割 的一种酶。 有 3 种限制性核酸内切酶，主要应用限制性核酸内切酶Ⅱ：是具有单一功能的酶，无甲基化作用，辅助因 子为 Mg 2+ , 识别特异性序列，在识别序列内或附近特异切割。 限制性核酸内切酶的切割特点 ①在 DNA 分子双链的特异性识别序列部位，切割 DNA 分子，产生链的断裂。 识别序列有连续的（如 GATC）和间断的 (如 GANTC) 两种，它们都呈回文结构 ② 2 个单链断裂部位在 DNA 分子上的分布， 通常不是彼此直接相对。断裂结果形成的 DNA 片段， 具有互补的单链 延伸末端。 三种酶切末端 :平齐末端、 5 ’粘性末端（如 EcoR Ⅰ）、 3 ’粘性末端（如 Pst Ⅰ） 同裂酶：来源不同的限制酶识别相同的核苷酸靶序列。产生同样的切割，形成同样的末端。 同尾酶：来源不同，识别的核苷酸靶序列也不相同，但切割后 DNA 分子产生的粘性末端相同的限制性核酸内切酶。 限制性核酸内切酶的活性影响因素 a 底物 DNA ： DNA 纯度、 DNA 浓度（ [DNA] 过大，抑制酶活，影响酶分子扩散 ）、识别位点及邻近位点特异性序 列 、DNA 二级 / 三级结构（超螺旋 DNA 比线状 DNA 需酶多）、提取时混入杂质可改变识别特异性 b 反应系统因素：缓冲液（无菌、无污染） 、金属离子（ Mg2+ ）、牛血清蛋白 (BSA 是酶稳定剂，可避免热、表面张 力、化学品导致的酶变性。过量 BSA 会引起电泳拖尾。 ) c 星活性 (可造成位点切割机率不等，降解不完全 ) 5. 限制性核酸内切酶的应用 : 重组 DNA 前的切割 、构建新质粒 、构建物理图谱 、DNA 分子杂交、用限制性内 切酶消化受体 DNA 、制备 DNA 探针 、亚克隆以用作序列分析 、基因定位， DNA 同源性研究 文档 实用 6. 甲基化酶分两类： 维持性甲基化酶： 用于在新合成的 DNA 链上进行甲基化的酶， 甲基化位置与模板链上的相同。 构建性甲基化酶：用于在非甲基化的 DNA 链上进行甲基化的酶。 作用：封闭 DNA 链中的某些识别位点，保护多余的限制性酶切位点。构建新的酶切位点 7. 核酸酶 S1 核酸酶 ：降解单链核酸。用于把具粘性末端的 DNA 变为平齐末端的 DNA 。在 DNA 部分变性条件下，能在富 含 AT 区切断 DNA 。切除单链中的突出末端和双链中的发夹结构 核酶： 具有酶活性的 RNA 片段，限制性内切酶二、 DNA 连接酶（ ligase ） 能够催化 DNA 中相邻的 3 ’- 羟基和 5 ’- 磷酸基末端之