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平板菌落计数法 （一）目的要求 学习平板菌落计数的基本原理和方法。 （二）基本原理 平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物 充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培 养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落 应代表原样品中的一个单细胞。统计菌落数，根据其稀释倍数和取 样接种量即可换算出样品中的含菌数。但是，由于待测样品往往不 易完全分散成单个细胞，所以，长成的一个单菌落也可来自样品中 的 2～3 或更多个细胞。因此平板菌落计数的结果往往偏低。为了清 楚地阐述平板菌落计数的结果，现在已倾向使用菌落形成单位 (colony-forming units，cfu)而不以绝对菌落数来表示样品的活菌含量。 平板菌落计数法虽然操作较繁，结果需要培养一段时间才能取 得，而且测定结果易受多种因素的影响，但是，由于该计数方法的 最大优点是可以获得活菌的信息，所以被广泛用于生物制品检验(如 活菌制剂)，以及食品、饮料和水(包括水源水)等的含菌指数或污染 程度的检测。 （三）器材 1．菌种大肠杆菌菌悬液。 2 ．培养基牛肉膏蛋白陈培养基。 3 ．仪器或其他用具 1mL 无菌吸管，无菌平皿，盛有 4.5ml 无菌 水的试管，试管架，恒温培养箱等。 （四）操作步骤 l．编号 取无菌平皿 9 套，分别用记号笔标明 10-4、10-5、10-6。(稀释 度)各 3 套。另取 6 支盛有 4.5mL 无菌水的试管，依次标是 10-1、 10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。 2 ．稀释 用 lmL 无菌吸管吸取 lmL 已充分混匀的大肠杆菌菌县液(待测样 )，精确地放0.5mL 至 10-1 的试管中，此即为 10 倍稀释。将多余 的菌液放回原菌液中。 将 10-1 试管置试管振荡器上振荡，使菌液充分混匀。另取一支 lml 吸管插入 10 1 试管中来回吹吸菌悬液三次，进一步将菌体分散、 混匀。吹吸菌液时不要太猛太快，吸时吸管伸人管底，吹时离开液 面，以免将吸管中的过滤棉花浸湿或使试管内液体外溢。用此吸管 吸取 10-1 菌液 lmL，精确地放0.5mL 至 10-2 试管中，此即为 100 倍 稀释。其余依次类推。 放菌液时吸管尖不要碰到液面，即每一支吸管只能接触一个稀 释度的菌悬液，否则稀释不精确，结果误差较大。 3 ．取样 用三支 1mL 无菌吸管分别吸取 10-4、10-5 和 10-6 的稀释菌悬 液各 lmL，对号放入编好号的无菌平皿中，每个平皿放0.2mL 。不要 用 lmL 吸管每次只靠吸管尖部吸 0.2mL 稀释菌液放入平皿臼，这样 容易加大同一稀释度几个重复平板间的操作误差。 4 ．倒平板 尽快向上述盛有不同稀释度菌液的平皿中倒入融化后冷却至 45 ℃ 左右的牛肉膏蛋白胨培养基约 15mL/平皿，置水平位置迅速旋动平 皿，使培养基与菌液混合均匀，而又不使培养基荡出平皿或溅到平 皿盖上。 由于细菌易吸附到玻璃器皿表面，所以菌液加入到培养皿后， 应尽快倒入融化并于已冷却至 45 ℃左右的培养基，立即摇匀，否则 细菌将不易分散或长成的菌落连在一起，影响计数。待培养基凝固 后，将平板倒置于 37℃恒温培养箱中培养。 5 ．计数 培养 48h 后，取出培养平板，算出同一稀释度三个平板上的菌 落平均数，并按下列公式进行计算， 每毫升中菌落形成单位(cfu)=同一稀释度三次重复的平均菌落数 ×稀释倍数×5 一般选择每个平板上长有 30~300 个菌落的稀释度计算每毫升的 含菌量较为合适。同一稀释度的三个重复对照的菌落数不应相差很 大，否则表示试验不精确。实际工作中同一稀释度重复对照平板不 能少于三个，这样便于数据统计，减少误差。由 10-4、10-5、10-6 三个稀释度计算出的每毫升菌液中菌落形成单位数也不应相差太大。 平板菌落计数法，所选择倒平板的稀释度是很重要的。一般以 三个连续稀释度中的第二个稀释度倒平板培养后所出现的平均菌落 数在 50 个左右为好，否则要适当增加或减少稀释度加以调整。 平板菌落计数法的操作除上述倾注倒平板的方式以外，还可以 用涂布平板的方式进行。二者操作基本相同，所不同的是后者先将 牛肉