超薄切片技术介绍.pptVIP

超薄切片技术;由于电镜电子束穿透能力的限制，必须把标本切成厚度小于0.1um以下的薄片才适用，这种薄片称为超薄切片。常用的超薄切片厚度是50-70nm。 在透射电镜的样品制备方法中，超薄切片技术是最基本、最常用的制备技术。超薄切片的制作过程基本上和石蜡切片相似，需要经过取材、固定、脱水、浸透、包埋聚合、切片及染色等步骤。 ;超薄切片主要步骤;1 取材、分割;(3)机械损伤要小，解剖器械应锋利，操作宜轻，避免牵拉、挫伤与挤压。 (4)操作最好在低温(0℃～4℃)下进行，以降低酶的活性，防止细胞自溶。 (5)取材部位要准确。 ? 1.2 取材方法： 将取出的组织放在洁净的韧性较大的纸上，滴一滴预冷的固定液，用新的、锋利的刀片成“拉锯式”将组织切下并修小，然后用牙签或镊子将组织块移至盛有冷的固定液的小瓶中。如果组织带有较多的血液和组织液，应先用固定液洗几遍，然后再切成小块固定。 ;2 固定;2.3常用固定剂有: (1)四氧化锇 (OsO4) 是一种强氧化剂，与氮原子有较强的亲和力，因而对于细胞结构中的蛋白质成分有良好的固定作用。它还能与不饱和脂肪酸反应使脂肪得以固定。此外，四氧化锇还能固定脂蛋白，使生物膜结构的主要成分磷脂蛋白稳定。它还能与变性DNA以及核蛋白反应，但不能固定天然DNA、RNA及糖原。四氧化锇固定剂有强烈的电子染色作用，用它固定的样品图象反差较好。锇固定的时间一般为1-2小时。;(2)戊二醛 ( ?C5H8O2) 戊二醛的优点是对糖原、糖蛋白、微管、内质网和细胞基质等有较好的固定作用，对组织和细胞的穿透力比四氧化锇强，还能保存某些酶的活力，长时间的固定(几周甚至1～2个月)不会使组织变脆。缺点是不能保存脂肪，没有电子染色作用，对细胞膜的显示较差。? 组织块固定常规采用戊二醛—锇酸双重固定法。分前固定和后固定，中间用磷酸缓冲液漂洗。前固定用2.5%戊二醛固定2小时以上、后固定用1%锇酸固定液固定1～ 2小时，pH7.2～7.4。固定完毕，用缓冲液漂洗20分钟后进行脱水 。 ;3 脱水;4 渗透和包埋; 当加入胺类时，就引起末端环氧基相连，形成首尾相接的长链状聚合物。这种促进末端相接的交联剂叫做催化剂或加速剂。常用的加速剂有2,4,6－三(二甲氨基甲基苯酚)(简称DMP(30)、二乙基苯胺及乙二胺等。为了改善包埋块的切割性能，某些环氧树脂包埋剂配方中还加有增塑剂，使包埋块具有适当的韧性。常用的增塑剂为邻苯二甲酸二丁酯(简称DBP)。 4.2包埋 包埋操作： 常规将组织块包埋在多孔橡胶包埋模板中，然后置烤箱烘干，在45℃(12小时)、60℃(24－36小时)烤箱内加温，即可聚合硬化，形成包埋块。 ; 包埋操作中应注意以下几点： (1)所有试剂要防潮，最好存放在干燥器中； (2)所用器皿应烘干； (3)配包埋剂时，每加入一种试剂要搅拌均匀； (4)包埋时动作要轻巧，防止产生气泡； (5)皮肤尽量不要接触包埋剂，以免引起皮炎； (6)盛放过包埋剂的容器要及时用丙酮清洗干净。 ;5 超薄切片; 半薄切片进行光学显微镜观察的目的： (1) 定位：通过光学显微镜观察，确定所要观察的范围，然后保留要用电镜观察的部分，修去其余部分。 (2)便于对同一组织的同一部位进行光学显微镜和电镜的对比观察。半薄切片定位以后，要对包埋块作进一步的修整。通常将块的顶端修成金字塔形，顶面修成梯形或长方形，每边的长度为0.2mm～0.3mm。 5.3制刀? ?超薄切片使用的刀有两种：一种是玻璃刀，另一种是钻石刀。由于玻璃刀价格便宜，使用者较多。制刀用的玻璃为硬质玻璃，厚度为5mm～6.5mm。 ? ?; 玻璃刀用制刀机制作。制好玻璃刀后，要围绕刀口制作一只水槽，以便使超薄切片漂浮在水面上。水槽有塑料水槽和胶布水槽两种。塑料水槽有固定的形状，可反复使用。胶布水槽是临时用胶布或专用塑料条制作的。装好水槽后，用熔化的石蜡封固接口，防止漏水。5.4载网和支持膜.(1) 载网 电镜中使用的载网有铜网、不锈钢网、镍网等，一般常用铜网。载网为圆形，直径3mm。网孔的形状有圆形、方形、单孔形等。网孔的数目不等，有100、200、300目等多种规格，可根据需要进行选择。 ;(2) 支持膜的制备 ? ? 挑选并清洗好载网之后，要在载网上覆盖一层薄膜，这层薄膜称支持膜，厚度为10nm～20nm。对支持膜的要求是透明无结构，并能承受电子束的轰击。常用的支持膜有火棉胶膜及聚乙烯醇缩甲醛膜(formvar膜)，一般采用后者。 ? ? ;5.5超薄切片机 超薄切片需用超薄切片机进行。 5.5.1超薄切片机分类 根据推进原理不同，将超薄切片机分为两