植物氨态氮测定.pdfVIP

植物组织氨基酸含量的测定（改良的茚三酮比色法） 一、实验原理 植物吸收的氮主要是氨态氮和硝态氮，后者经过还原过程形成氨， 前者经同化后形成谷氨酰胺和谷氨酸，然后形成其他氨基酸和蛋白质。 测定氨态氮的方法有多种，本实验为改良的茚三酮比色法。 α-氨基酸与水合茚三酮溶液一起加热，经氧化脱氨变成相应的 α-酮酸，酮酸进一步脱羧变成醛，水合茚三酮则被还原，在弱酸环 境中，还原型茚三酮，氨和另一分子水合茚三酮反应，缩合生成蓝紫 色物质。根据蓝紫色的深浅，在 580nm 波长下测定吸光值。本实验中 在茚三酮试剂中添加乙二醇并补加正丁醇和丙醇，可以克服茚三酮的 不稳定性。 二、仪器设备 研钵、烧杯、漏斗、量筒、具塞试管、三角瓶、容量瓶、移液管、天 平、沸水浴锅、可见分光光度计 三、试剂 1. 10%醋酸 (100mL) 2. 1% 抗坏血酸（100mL） 3. 5 μg/mL 亮氨酸或丙氨酸溶液（0.005g 定容至 1000mL） 4. pH5.4 醋酸缓冲液：8.8mL 0.2mol/L 醋酸（冰醋酸 11.55mL 稀释 至 1000mL）加41.2mL 0.2mol/L 醋酸钠（醋酸钠 16.4g 或三水醋酸钠 27.2g 配成 1000mL）。 5. 水合茚三酮试剂：1.1g 茚三酮放到烧杯中，加入 15mL 正丙醇，摇 匀，溶解，后加入 30ml 正丁醇 60ml 乙二醇，混匀，再加9mLpH5.4 醋酸缓冲液，混匀。保存于棕色瓶中，冰箱保存，适用期限 10 天。 四、操作步骤 1. 标准曲线的绘制 以下表所示量从 5 μg/mL 亮氨酸或丙氨酸溶液中分别取溶液并 在每个试管中加蒸馏水至 2mL，对照仅加 2mL 蒸馏水，后在各试 管中加入 3mL 水合茚三酮试剂 0.1mL 1%抗坏血酸，摇匀。盖上 试管塞，于沸水中加热 15 分钟，取出后搅拌冷却 15 分钟。冷却 后的有色溶液中加无水乙醇至 10mL，在波长 580nm 处测吸光值， 以氨态氮浓度（μg/mL）为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲 线。 试管号 1 2 3 4 5 6 7 试剂（mL） 0 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 1.8 氨态氮浓度 0 0.5 1 2 3 4 5 （μg/mL） 2. 称取 0.5g 新鲜植物材料，放入研钵中，加入 5mL 10%醋酸，研磨 后以蒸馏水稀释至 100mL ，混匀，通过滤纸过滤，弃去最先滤下 的一部分滤液后过滤到 100mL 三角瓶中。 3. 从剩下的滤液中取 2mL 放入试管中，加 3mL 水合茚三酮试剂 0.1mL 1%抗坏血酸，摇匀。盖上试管塞，于沸水中加热 15 分钟。 同时将盛有对照溶液（提取液用蒸馏水代替）的试管加热。 4. 取出后搅拌冷却 15 分钟。加热形成的红色茚三酮试剂被氧氧化而 褪色，茚三酮与氨基酸形成的蓝紫色反应产物仍然存留并变得更 加鲜明。冷却后的有色溶液中加无水乙醇至 10mL ，混匀。在波长 580nm 处测光密度值，根据标准曲线查得数值代入以下公式计算氨 态氮含量。 -6 （10 ×100×C） X （100g 样品中的氨态氮毫克数）= ×100 n C：比色液中氨态氮浓度（μg/mL） n：样品重量（g） 100：分析溶液总体积（mL） 5.实验结果与分析 氨态氮含量标曲： 序号 1 2 3 4 5 6 7 氨态氮浓度 0 0.5 1 2 3