荧光定量PCR关键技术.doc

常规PCR中，在扩增反应结束以后，我们通常经过凝胶电泳方法对扩增产物进行定性分析，无法对PCR扩增反应进行实时检测，也无法对起始模板正确定量，而很多情况下，我们所感爱好是起始模板量，如转基因动植物中插入某种外源基因拷贝数或病人中某种病毒DNA/RNA正确copy数等，如此，荧光定量PCR技术便应运而生。1、荧光定量PCR概念所谓定量PCR技术（real-time PCR），是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最终经过特定数学原理对未知模板进行定量分析方法（以下图）。 2、荧光定量PCR和一般PCR关键区分理论上PCR是一个指数增加过程，不过实际PCR扩增曲线并不是标准指数曲线，而是S形曲线。这是因为伴随PCR循环增多，扩增规模快速增大，Taq酶、dNTP、引物，甚至DNA模板等多种PCR要素逐步不敷需求，PCR效率越来越低，产物增加速度就逐步减缓。当全部Taq酶全部被饱和以后，PCR就进入了平台期。因为多种环境原因复杂相互作用，不一样PCR反应体系进入平台期时机和平台期高低全部有很大改变，难以正确控制。所以，即使是96次PCR反复试验，多种条件基础一致，所得结果有很大差异（以下图），所以在试验过程中我们不能依据最终PCR产物量直接计算出起始DNA拷贝数。 而从上图我们也能够看出，即使相同模版在同一台PCR仪上进行96次扩增，终点处检测产物量不恒定，但96次PCR扩增曲线全部有一个共同拐点，而且拐点极具重现性，为荧光定量PCR技术应用提供了理论基础。3、多个基础概念为了使大家愈加好了解、掌握荧光定量PCR技术，接下来有必需向大家介绍多个最基础概念。3.1扩增曲线为了愈加好了解荧光定量PCR原理，我将用样品扩增曲线来进行说明。描述PCR动态进程曲线即扩增曲线。前面我们也了解到，PCR扩增曲线实际上并不是一条标准指数曲线，而是呈S型曲线(以下图) 从上图我们能够很直观看出，荧光定量PCR扩增曲线能够分成三个阶段：荧光背景信号阶段（基线期），荧光信号指数扩增阶段（对数期）和平台期。在基线期，扩增荧光信号被荧光背景信号所掩盖，我们无法判定产物量改变。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级增加。因为PCR终产物量和起始模板量之间没有线性关系，所以依据最终PCR产物量不能计算出起始DNA拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量对数值和起始模板量之间存在线性关系，我们能够选择在这个阶段进行定量分析。3．2荧光阈值 我们通常把荧光PCR前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline，基线期），即样本荧光背景值和阴性对照荧光值，扩增荧光信号被荧光背景信号所掩盖。荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定一个值，它能够设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，荧光域值缺省设置是3～15个循环荧光信号标准偏差10倍（机器自动设置）。我们在做荧光定量PCR试验时，常常采取手动设置，手动设置标准要大于样本荧光背景值和阴性对照荧光最高值，同时要尽可能选择进入指数期最初阶段，真正信号是荧光信号超出域值（以下图）。 3．3 Ct值了解了荧光阈值概念后，Ct值就很好了解了。C代表Cycle，t代表threshold，所谓Ct值就是在荧光PCR扩增过程中，当扩增产物荧光信号达成设定阈值时所经过扩增循环次数。 如上图所表示，黑色线显示是荧光阈值，当信号超出黑色线时所经历循环数即为Ct值。因为Ct值即达成荧光阈值所经过循环数，所以它就和模版拷贝数存在着线性关系，起始拷贝数越多，经过循环数就越少，Ct值也就越小，反之亦然。正常CT值范围在18-30之间，过大和过小全部将影响试验数据精度。前面也提到过，同一模板经过96次PCR扩增，扩增产物即使不恒定，但Ct值极具重现性。依据这个特点，我们能够利用已知起始拷贝数标准样品Ct值做出标准曲线，只要在同一次PCR试验中得到未知样品Ct值，就能够依据曲线算出该未知样品起始拷贝数。3．4标准曲线在绝对定量试验过程中，我们能够将已知浓度标准品进行梯度稀释，将未知样品和梯度稀释标准品在同一荧光PCR试验中进行反应，将稀释标准品得到Ct值构建标准曲线，经过标准曲线能够推算出未知样品量（以下图）。荧光定量PCR标准曲线示意图 理论上，一系列稀释样品扩增曲线之间有均匀间距（上图左），假如PCR反应呈理想方法扩增，产物在每一循环全部加倍，荧光曲线之间间距则符合等式“2n＝稀释倍数”，n为2样本间Ct值差。比如：10倍稀释样本，2n＝10，可得n＝3.32，Ct值差3.32。3．5扩增效率扩增效率和标准曲线斜率相关，计算方程为：扩增效率（E）＝10-1/斜率。理论上，在每个指数扩增循环中，PCR产物量加倍，即PCR产物2倍增加，反应效率为2，扩增效率就为2，就可得2＝10-1/