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HisTrap HP和 HisTrap FF进行纯化中文操作指南 HisTrap HP  和  HisTrap FF是 1 毫升和  5 毫升的  HiTrap 柱子，分别预装了  Ni Sepharose High Performance 或 Ni Sepharose 6 Fast Flow柱材。上样、洗涤、洗脱过程可以用带有配套适配器的注射器、  蠕动泵或者如  ?KTAdesign 一样的层析系统完成（仪器选择请参见表  8）。 HisTrap HP  和  HisTrap FF的柱管由聚丙烯制成， 具有生物兼容性并且不与生物分子发生相互作用。  顶端和底 端由多孔的聚乙烯烧结而成。柱子在运输时入口被塞子堵住，而出口被封死，但可以掰断。每个包装都含 有所有用于把柱子连接到不同仪器上的必需配件。为快速放大纯化规模，两个或者三个 HisTrap 柱子（  1 毫升或 5 毫升）可以串联使用（柱压会高些） 。注意， HisTrap HP和 HisTrap FF 柱不能打开或者再次填装。 样品制备 通用的样品制备过程请参照 26 页。 通过加入缓冲液、氯化钠、咪唑和添加剂的浓储液，用结合缓冲液稀释样品，或者通过交换缓冲液等手段 来调节样品适应结合缓冲液的组成和 pH 值。在样品和结合缓冲液中添加低浓度的咪唑对于防止有组氨酸暴露在外的宿主细胞蛋白结合在柱上是必要的（见第 4 章）。 在使用样品前一刻，将样品用或 μm的滤膜过滤，并且（或者）离心。如果样品过于粘稠，为了防止堵塞 柱子，需用结合缓冲液稀释样品、增加裂解操作（离心、匀浆）或加入 DNase/RNase 来降低核酸片断的大 小。 准备缓冲液 结合缓冲液： 20mM 磷酸钠， 氯化钠， 20-40mM 咪唑， （最优的咪唑浓度是蛋白依赖的， 20-40mM 适 合于大多数蛋白） 洗脱缓冲液： 20mM 磷酸钠， 氯化钠， 500mM 咪唑， 用于准备缓冲液的水和化学品应该是高纯的。用高纯的咪唑，这会在 280nm 处无紫外吸收或低吸收。 纯化 1. 将注射器或泵管用蒸馏水装满。移除塞子，把柱子连接到注射器（用提供的接头） 、蠕动泵或层析系统 上。保持连接处一直有液体避免向系统中引入气泡。 除掉柱子底部的密封。 用 3 到 5 倍柱体积的去离子水洗去乙醇。 4. 用至少 5 个柱体积的结合缓冲液平衡柱子。 建议流速是 1ml/min（1 毫升柱子）和 5ml/min（ 5 毫升柱子）。 5. 用注射器或者蠕动泵加入预处理的样品，为获得最好的结果，在上样时，用 min （1 毫升柱子）和 min （5 毫升柱子）的流速。 用结合缓冲液洗涤至少 5 到 10 个柱体积，直到吸收达到平稳的基线或在流出物中没有物质流出。在洗涤的过程中保持流速为 1-2 ml/min （1 毫升柱子）和 5-10 ml/min （5 毫升柱子）。 7. 用洗脱缓冲液采用一步洗脱或者线性梯度洗脱。对于分步洗脱，通常  5 个柱体积即可。对于线性梯度洗 脱，通常  10 到 20 个柱体积即可。在洗脱的过程中保持  1-2 ml/min （ 1 毫升柱子）和  5-10ml/min （ 5 毫升柱 子）的流速。 洗脱后，用 3 到 5 倍柱体积的结合缓冲液洗涤柱子。柱子即可用来进行下一次纯化。 当使用注射器时， 1ml/min 对应于大概每分钟 30 滴（ HitTrap 1 毫升柱子），5ml/min 对应于大概每分钟 120 滴（ HiTrap 5 毫升柱子）。 如果纯化同一蛋白，柱子不需要进行金属离子的剥离和重新装载的过程。重复使用任何的柱子都取决于样 品的性质，同一柱子应该用来纯化相同的蛋白，以避免交叉污染。关于本话题以及柱子清洗和储存的更多 信息请参见附录 1。 Ni Sepharose 与还原剂兼容。 然而，我们建议在加入含有还原剂的缓冲液 / 样品之前，除去任何弱结合的 Ni2+ 离子。这可以通过用不含还原剂的一个空白运行来实现（见下文） 。不要把 HisTrap 用含有还原剂的缓冲液 保存。 在所有正常的情况下， 从  Ni Sepharose  上泄漏的  Ni2+离子很少。该介质的泄漏比其他检测的预装载的  IMAC 介质都要低。 对于非常苛刻的应用，纯化过程中 Ni 的泄漏可以通过在上样前进行空白运行（见下文）而进一步降低。 空白运行 使用不含还原剂的结合缓冲液和洗脱缓冲液。 1. 用 5 个柱体积的蒸馏水洗涤柱子以除去 20%乙醇。 用 5 个柱体积的洗脱缓冲液洗涤。 用 10 个柱体积的结合缓冲液平衡柱子。