qPCR操作步骤[实用].pdfVIP

具体的操作步骤是，RNA 提取，随机引物反转录，反转录产物10 倍稀释，real-time PCR.这个是标准的 两步法。一步法是把反转录和扩增联合起来做，不推荐使用。 具体的注意事项有 1：高质量的RNA 获取，这里的高质量不是强调RNA 降解，而是强调RNA 的纯度，不能含有基因组 DNA,以及其他杂质污染。基因组DNA 的存在会导致定量偏高，给你错误的结果，所以一般用于定量 PCR 的RNA 必须使用DNase 处理，消除DNA 污染。而RNA 中的杂质的污染会限制real-time PCR 的 反应，导致扩增失败，给你假阴性的结果。RNA 的降解不是关键，一个是因为定量PCR 的引物扩增目的 长度本身很短，150-250 个bp，并不用于扩增目标基因的全长。此外是因为存在内参基因，所以RNA 降 解会通过内参基因的测定来平衡。毕竟一旦发生降解，所有的RNA 以同样的速度降解，而相对比率不会 改变。 2 ：减少加样误差， 在使用SYBR Green MIX 的时候，一定要先按照反应的量（比如8 个孔）把所有的 试剂一次性配成MIX 然后分装，留出5 微升的反应体系给模板，为什么要使用5 微升，是因为只有5 微 升以上，加样枪的误差才会比较小，如果你仅仅是吸取一微升的话，手重一点或者轻一点都会造成极大的 加样误差，严重影响你的定量精确度。 3 。选择合适的内参基因，一般用于定量PCR 的内参基因有好几种，但却没有完全通用的内参基因。具 体到不同来源的细胞，比如不同组织来源，或者是动物等等，内参基因会有差异，最好的办法是，在你的 样品上先测试内参基因，找到变化最小，最稳定的一个。 4 。合适的引物设计，避免出现引物二聚体，非特异性扩增等等 Q-PCR 实验流程 一、 ①实验前准备，每天早上到实验室后，先把超净工作台的紫外灯打开15-20 分 钟。②超净台前做实验，需佩戴干净的橡胶手套/一次性薄膜手套，RNA 抽提需带口罩。 ③取EP 管/枪头时需用镊子，不可以用使用过的手套直接取用。取完EP 管/枪头后，袋子 及时封好。④橡胶手套须放入超净台照射紫外，实验操作过程中不得带出超净台，移液器 在一天工作结束后调至最大量程，并用75%乙醇清洁移液器，枪头盒及超净台面。⑤实验 进行的过程中或观看实验时，没有带口罩不要在超净台前讲话。 二、 总RNA 抽提 1)细胞培养皿中细胞样品用1*PBS 洗两次后，用1ml 枪将PBS 吸干净，加入1ml Trizol (invitrogen)溶液，吹打混匀，并吸至1.5ml RNase free EP 管中使细胞充分裂解， 室温静置5min; 组织样品用液氮充分研磨，加入1ml Trizol (Invitrogen)溶液，混匀，室温放置5min 使其充分裂解;(管盖与管壁都需标记样品名称) 2)加入200μl 氯仿，剧烈振荡混匀30s，使水相和有机相充分接触，室温静置3- 5min;(离心时离心管按顺序排放，离心完毕，离心管的顺序也按顺序排好，与第一步的顺 序一致) 3) 4 ℃下，14,000g 离心15min，可见分为三层，RNA 在上层水相，移至另一个新的 RNase free EP 管;(用20-200ul 的枪吸取上清，吸上清时，枪头应沿着液面上层吸取上清， 枪头不可碰到、吸到中间层) 4)沉淀RNA：加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀(颠倒6-8 次)(不应用振荡器混匀)， 室温静置10min; 5)4℃下，14,000g 离心10min，收集RNA 沉淀(如离心后仍不见EP 管底部有沉淀， 应将EP 管放置在-80 度冰箱过夜，继续在4 ℃下，14,000g 离心10min，收集RNA 沉淀)， 去上清; 6)用75%乙醇洗涤两次(12,000g 离心5min)(加入乙醇后只需轻轻颠倒EP 管即可，不 用振荡器震荡或枪头吸打沉淀)，超净台风干;沉淀不能过干或过湿，过干则不易溶解，过 湿则乙醇残留。 7)视沉淀量加入适量DEPC 水(至少15ul)溶解沉淀。 三、去基因组 使用RNase-free 的DNase І(Promega)，按以下体系配置反应液，37℃消化 30min，65℃灭活10min。 RNA 30 µl DNase І 20 µl 10 x buffer