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免疫学实验报告 姓名 : 买迪来木 . 坎代尔 学号 :201020131222 班级 :2010131 实验一：多克隆抗体的制备和抗体效价的检测 一：实验原理 有了质量好的抗原，还必须选择适当的免疫途径，才能产生质量好的抗体。 质量好的抗体的标准：特异性强和效价高 多克隆抗体的概念：在含有多种抗原决定簇的抗原刺激下，体内多个 B 细 胞 克隆被激活并产生针对多种不同表位的单克隆抗体， 其混和物为多 克隆抗体。 机体内所产生多克隆免疫血清实质上是由多种抗体组成的 混合物，又称多克隆 抗体。 多克隆抗体产生的基本原理： 初次反应的抗体持续时间较短，亲和力也较低，多无实际应用价值。 机体初次 接触抗原后，激发体液免疫应答反应。在 Moslash; 和 Th 的作用下， B 细胞 被激活 , 增生分化为浆细胞和记忆 B 细胞（ Bm）。 浆细胞产生特异性抗体。由 于初次反应时，只有少量对该抗原特异的 免疫活性细胞被诱导而增生分化为浆 细胞。随着抗原的消耗， 抑制 T 细胞（Tc）的激活和循环抗体的反馈抑制作用， 浆细胞减少，抗体滴 度很快下降。 二次反应产生的抗体主要是高亲和力的 IgG 。 机体再次受同一抗原刺激后，对 该抗原特异性的 Bm 迅速增殖分化为 浆细胞，产生特异性抗体。 Th 的记忆细 胞也加快反应的进行，在抗 原作用 1~2 天后，抗体滴度迅速上升。抗体合成率为初次反应的几 倍到几十 倍。 用于免疫的动物 用于免疫的动物可以是哺乳类和禽类，可以是 羊、马 、兔 、鸡等，实验 室常用兔、山羊和豚鼠。 动物种类的选择标准： 1. 根据抗原的生物学特性和所需获得的抗血清数。 2. 用于免疫的动物需适龄、健壮、无感染性疾病， 最好为雄性。 3. 十分注意动物的饲养，消除动物个体差异及在免 疫过程中死亡的影响。 4. 如果用兔子，最好用纯种新西兰兔，一组三只， 体重 2-3kg 为宜。 免疫途径： 途径有很多种：静脉注射、腹腔内注射、肌肉内注射、皮内注射、皮下注射、 淋巴结内注射等。 一般选择多点皮内或背部注射，每点注射 0.1ml 左右。 佐剂： 由于不同个体对于同一抗原的反应性不同，而且不同抗原产生免疫反应的也 有强有弱，因此常常在注射抗原的同时，加入能增强抗原的抗原性的物质，以 刺激机体产生比较强的免疫反应，这种物质称为免疫佐剂。 佐剂作用：刺激网状内皮系统，使参与免疫反应的免疫活性细胞增多，促进 T 细胞与 B 细胞的相互作用，从而增强机体对抗原的细胞免疫和抗体的产生。 常用佐剂：福氏佐剂。 制备方法流程： 纯化的抗原→与弗氏佐剂一起充分乳化→注射动物体内 （剂量，次数，途 经等均要适宜，每隔两周注射一次，注射三次） →测定效价 （如效价高， 则不必加强免疫） → 1 周 后经动脉放血→分离血清→纯化抗血清备用。 抗血清的采集与保存： 收集的血液应置于室温下一小时左右，凝固后，置于 4 摄氏度下，过夜析出 血清，离心，10000rpm，10min。 在无菌条件下，析出血清，分装（0.05-0.2ml ）， 贮于 -20 摄氏度以下冰箱，或冻干后贮存于 4 摄氏度冰箱保存。 二．实验步骤 器材： 剪刀（剪兔毛用）一把、弯头眼科手术镊子（游离血管用）一把、直 头眼科手术剪（剪血管用）一把，手术刀架，手术刀片，注射器(1ml 、 10ml， 25ml) 附针头，兔子固定架，灭菌三角烧瓶 (200ml) 或平皿（直径 18cm）、弯头止 血钳四把，直头止血钳两把，手术缝合线，塑料放血管，纱布等。 2. 试剂： 生理盐水 ( 或 PBS)， 弗氏完全佐剂（ Freund’s complete adjuvant, FCA ） Sigma F-5881 ， 弗氏不完全佐剂 (Freund ’s incomplete adjuvant, FIA) Sigma F-5506 ， 兔子的选择： 兔子的重量应在四斤以上，两耳光滑，明显可见耳静、动脉，健康。 步骤： 背部多点注射法：（ 1）在家兔脊柱两旁选几个点进行皮下注射制备好的抗原， 每点注射 0.1ml 。 （2）间隔两周之后选择与上次不同的点注射 （3）再间隔两周两周，继续选择不同的点进行注射抗原。 (4) 免疫一周之后，从兔子的耳动脉取血检测抗体效价，效价 较高，则不用继续进行加强免疫，即可获得高效价的抗体。 血清的分离： 如果用三角瓶或平皿盛血， 将器皿倾斜放置于 37℃烘箱 2hr ，转移到 4℃沉淀过夜，第二天早上用吸管吸取血清。如果用离心管收集， 37℃烘箱放置 2hr ，转移 4℃沉淀过夜， 第二天早上离心， 10000RCF，10 分钟。在血清中加入 NaN3 至终浓度 0.02%，分装后 -20 ℃保存。 连续很多天都是天亮之后才睡觉。别人问我，你晚上