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病毒转染原理及步骤 在细胞相关的实验操作中，对于一些按常规方法难以转染甚至无法转染的细胞， 通过病毒介导的实验能够大大提高基因的转导效率，以达到目的基因的高效瞬 时表达。 病毒转染包括以下步骤：1 构建载体 2 包装提纯病毒 3 感染靶细胞。以慢病毒 为例。 慢病毒（Lentivirus ）载体是以HIV-1 （人类免疫缺陷I 型病毒）为基础发展起 来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞 均具有感染能力。慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。该载体 可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。在感染能 力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、 干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展 了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。 一、慢病毒载体构建原理： 慢病毒载体的包装系统一般由两部分组成，即包装成分和载体成分。包装成 分由HIV-1 基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能 够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白；载体成分则与包装成分互补，即含有 包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列，同时具有异源启动子控制下的多克 隆位点及在此位点插入的目的基因。将包装成分与载体成分的多个质粒共转染 包装细胞，即可在细胞上清中收获携带目的基因的复制缺陷型慢病毒载体颗粒。 慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包 装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助 蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细 胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中， 离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞 之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。 对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等,能大大提高 目的基因转导效率，而且目的基因整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，这 就为RNAi ，cDNA 克隆以及报告基因的研究提供了一个有利的途径。对进行 稳转细胞株的筛选，为活体动物模型实验提供高质量的包含目的基因的病毒液 提供基础。 二 、慢病毒载体构建及包装流程： （一）实验流程（1 和2 为并列步骤） 1.慢病毒过表达质粒载体的构建 设计上下游特异性扩增引物，同时引入酶切位点，PCR(采用高保真 KOD 酶，3K 内突变率为0%)从模板中（CDNA 质粒或者文库）调取目 的基因CDS 区（coding sequence ）连入T 载体。将CDS 区从T 载体上 切下，装入慢病毒过表达质粒载体。 2.慢病毒干扰质粒载体的构建 合成siRNA 对应的DNA 颈环结构，退火后连入慢病毒干扰质粒载体 3. 慢病毒载体的包装与浓缩纯化 制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进 行高纯度无内毒素抽提，共转染293T 细胞，转染后6 h 更换为完全培 养基，培养24 和48h 后，分别收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，病毒 上清液通过超离心浓缩病毒。 （二）实验材料：慢病毒载体、包装细胞和菌株 该病毒包装系统为三质粒系统，组成为pspax2, pMD2G, pLVX-IRES- ZsGreen1/pLVX-shRNA2 。其中质粒上的ZsGreen1 表达框能表达绿色荧 光蛋白（GFP ）。 细胞株 293T ，慢病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长 培养基为DMEM(含10% FBS) 。贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。 菌株大肠杆菌菌株DH5α 。用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。 三、慢病毒转染细胞实验方法 （一）慢病毒转染贴壁细胞实验方法 5 1、慢病毒转染前18-24 小时，将贴壁细胞以1×10 /孔铺到24 孔板中。使细胞