植物病原真菌的分离培养.pdfVIP

实验十三 植物病原真菌的分离培养 一、实验原理 植物患病组织内的真菌菌丝体，如果给予适宜的环境条件，除个别种类外，一般都能 恢复生长和繁殖。植物病原菌的分离就是指通过人工培养，从染病植物组织中将病原真菌 与其它杂菌相分开，并从寄主植物中分离出来，再将分离到的病原菌于适宜环境内纯化， 这个过程总称植物病菌的分离培养。植物病原真菌的分离一般都是采用组织分离法，就是 切取小块病组织，经表面消毒和灭菌水洗过后，移到人工培养基上培养。 二、实验目的： 植物病原菌的分离培养是植物病理学实验最基本的操作技术之一，它对原害鉴定，病 原形态观察、植物病害接种体的培养等方面都是经常使用的研究手段。通过本实验，要求 植物病原菌分离培养的一般原则和方法。 三、实验材料及准备： 1．分离材料：梨黑斑病（Alternaria kikuchiana ），柿树圆斑病（Pestnlotia sp ）及杉木 炭疽病（Glomerella cingolata ）新发病的病叶；杨树烂皮病（Cytospora chrysosperma ）国 槐腐烂病（Dothiorella sp. ）的带有新病斑的枝条；油松种子。 2 ．分离用具（每小组为单位） 酒精灯4 个，手术剪4 把，眼科镊4 把，PDA 培养基3 瓶，培养皿（Φ9cm ）24 套， 小烧杯（5ml ）4 个，大烧杯 1 个，斜面培养基 12 管，灭菌水4 瓶，75%酒精瓶 1 个（内 放脱脂棉球）0.1%升汞瓶1 个，5%乳酸瓶（60ml ）1 个，火柴1 盒，湿、干纱布各4 张。 四、实验方法及步骤： （一）、分离前的准备工作： 1．工作环境的清洁和消毒 分离培养一般在无菌室、无菌箱或无菌工作台（超净工作台）上进行，无菌室和无菌 箱要经过喷雾除尘，并用药物或紫外线照射消毒（常用消毒药物为 70%酒精，2%煤酚皂 液，5%石炭酸液等喷雾。若用紫外线灯照射则需 20-30 分钟）。在没有上述设备条件时， 在清洁房间里关闭门窗，避免空气流动，经过喷雾除去空气及地面灰尘后进行操作，也可 获得较好的结果。工作前擦净桌面，最好铺上湿纱布。将所需用的物品按次序放在工作台 上，避免工作时走动，工作人员最好穿上灭菌后的工作服，带上口罩，并用肥皂洗手，用 70%酒精或0.1%新洁尔灭擦手。 2 ．分离用具的消毒 凡是和分离材料接触的器皿（刀、剪、镊、针等）都要随时（至少在使用时）保持无 菌，将这些用具浸于70%酒精中，使用时在灯焰上灭菌烧去酒精，如此2-3 次（刀、剪、 镊等不宜在灯焰上烧时过长，以防退火）。再次使用时必须重复灭菌。培养皿、试验等要 1 经过干热灭菌。培养基及洗涤或稀释用蒸馏水都需要事先经过高压蒸气灭菌。 3 ．分离材料的选择 用新发病的植株、器官或组织做为分离材料，可以减少腐生菌的污染。任何植物坏死 部分的内部或表面，都可能有腐生微生物的孽生，所以一般斑点病害应从邻近健全组织， 即从病、健组织交界处获得分离材料。 （二）、植物病原菌的分离 1．叶斑类和枝杆病斑类（非维管束侵染）病原菌分离： 首先选择具有典型症状的新鲜病叶作为分离材料，按下述步骤操作： ①培养基平板制备：将 PDA 培养基在微波炉中加热熔化验，以无菌操作法将溶化过 的培养基倾注入灭过菌的培养基中，每皿经12 毫升，可形成2-3 毫米厚的平板。（为防止 细菌污染，倒碟前给每三角瓶内加6%乳酸4-6 滴）。 ②病叶或病枝经自来水冲洗，从病斑周转 1-2 毫米处的健组织部位剪下（若为枝干， 则将带有病斑的皮层剥下，但）。 ③取 10 毫升小烧杯经酒带消毒，放入分离材料，倒入0.1%升汞液适量作表面消毒一 分钟，或用1%漂白粉消毒均可。 ④消毒后倾出消毒液，用无菌水冲洗2——3，最后一次无菌水不要倒掉。 ⑤用灭菌镊，剪在无菌水中将分离材料剪成 2——3 毫米大小的方块，每块组织均应 为病健相间组织。用灭菌镊子夹取剪好的材料，放入培养基平板上，轻轻按压。每皿 4— —5 块，排放均匀。 ⑥用蜡笔在培养皿上注明分离代号，日期、姓名，将培养皿翻转放置于23—25 ℃ ⑦3——4 日后挑选由分离材料上长出的典型而无杂菌的菌落，在菌落边缘用移菌针挑 取带有菌丝的培养基一小块，转入试管斜面培养基中央，于25 ℃温箱中培养。