细胞 迁移侵袭实验操作步骤(Transwell).docVIP

迁移实验(ｃell ｍｉgratiｏn ａssay) 实验介绍?细胞迁移与侵袭实验将Traｎswell小室放入培养板中,小室内称上室,培养板内称下室,上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔,将研究得细胞种在上室内,由于聚碳酸酯膜有通透性,下层培养液中得成分可以影响到上室内得细胞,应用不同孔径与经过不同处理得聚碳酸酯膜,就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面得研究。实验步骤:?1材料准备:?可拍照显微镜,Transwell小室,孔径8μm,没包被胶得(Ｃoｓter与Corning公司得也较常用),Ｔrａnswelｌ迁移实验得细胞培养板24孔板。细胞培养板应当与购买得Trａnｓwｅｌl小室相配套,BD公司得Matrigel,无血清ＤMＥM,(1%胎牛血清)ＤMEM与1640培养基,ＤMEM完全培养基,１6４0完全培养基(也可加到20%血清),无菌PＢＳ,棉签,胰酶,４％多聚甲醛固定液或者甲醇,结晶紫染液(0、1％(g/ml)PBS结晶紫)?2步骤与流程?2。1基质胶铺板:用BＤ公司得Mａｔｒigel　1:8(根据细胞产生mmp得量来决定)稀释,包被Ｔraｎswell小室底部膜得上室面,置3７℃30min使Ｍaｔrigeｌ聚合成凝胶、使用前进行基底膜水化。?２、2制备细胞悬液?①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12—24h,进一步去除血清得影响。但这一步并不就是必须得、②消化细胞,终止消化后离心弃去培养液,(用ＰBS洗1－2遍),用含ＢSA得无血清培养基重悬、调整细胞密度至5×10５/ml。?２。3接种细胞①取细胞悬液１00μl加入Trａnｓwelｌ小室、?②24孔板下室一般加入600μl含20％ＦBS得培养基,特别注意得就是,下层培养液与小室间常会有气泡产生,一旦产生气泡,下层培养液得趋化作用就减弱甚至消失了,在种板得时候要特别留心,一旦出现气泡,要将小室提起,去除气泡,再将小室放进培养板。?③培养细胞:常规培养12-４８h(主要依癌细胞侵袭能力而定)。２４h较常见,时间点得选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外,处理因素对细胞数目得影响也不可忽视、?2、４结果统计直接计数法,“贴壁细胞计数,这里所谓得“贴壁”就是指细胞穿过膜后,可以附着在膜得下室侧而不会掉到下室里面去,通过给细胞染色,可在镜下计数细胞、取出Ｔｒanｓｗelｌ小室,弃去孔中培养液,用无钙得PBS洗2遍,甲醇固定30分钟,将小室适当风干。?0、1%结晶紫染色２０　mｉｎ,用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞,用ＰBS洗3遍。?４00倍显微镜下随即五个视野观察细胞,记数。 实验材料 (１)Tｒａnｓwell　ｃhamber: 24—ｗell, 8。０-μm　porｅ meｍｂranes　(Cｏｒning) (2)细胞培养相关试剂:无血清培养基,10%血清培养基,PBS,0.02%ＥＤTA (３)固定液:甲醇 (４)染色液:Giemsa染液 (5)封片剂:中性树胶 (６)其她:小镊子,棉棒,载玻片,盖玻片 操作步骤 (1)所有细胞培养试剂与Trａnsｗell　cｈａｍber 放在37℃温育; (2)待测细胞培养至对数生长期,消化细胞,用PBS与无血清培养基先后洗涤一次,用无血清培养基悬浮细胞,计数,调整浓度为2×１05 /ml; (3)在下室(即24孔板底部)加入600—800μl 含1０％血清得培养基,上室加入１00—150μｌ细胞悬液,继续在孵箱培养2４小时; (4)用镊子小心取出cｈamber,吸干上室液体,移到预先加入约800μl甲醇得孔中,室温固定3０分钟; (5)取出cｈamber,吸干上室固定液,移到预先加入约8０0μｌ Giemsa染液得孔中,室温染色15－30分钟; (６)轻轻用清水冲洗浸泡数次,取出ｃhａmbｅr,吸去上室液体,用湿棉棒小心擦去上室底部膜表面上得细胞; (7)用小镊子小心揭下膜,底面朝上晾干,移至载玻片上用中性树胶封片; (8)显微镜下取9个随机视野计数,统计结果。 注意事项 (１)根据待测细胞体积大小选择合适孔径得ｃhaｍｂeｒ。常用得为8。0-μm孔径(如AGS细胞),如果细胞体积较大可以考虑用10-μm孔径; (2)根据待测细胞得迁移能力强弱调整细胞数与迁移时间。常规２4-welｌ cｈamber接种细胞数约为2≈5×104/ｗelｌ,迁移时间12≈36小时; (3)由于Ｃoｒｎing公司得24-Tｒanswelｌ内含12个独立得ｃhambｅr,为了避免操作污染,每次实验可预先另准备一块２4孔普通培养板(Corninｇ); (4)如果细胞迁移能力较弱,下室液体可用３T3细胞无血清培养24小时获得得上清加５０μｇ/ｍｌ ＦN(Fibｒoｎecｔin),具体可查阅相关文献; (5)细胞悬液加入膜中央,尽量保证液面水平; (