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PCR经验总结 primers desig n 这是最重要的一步。 理想的，只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火的引物要符合 下面的一些条件 a足够长，18-24bp,以保证特异性.当然不是说越长越好，太长的引物同样会降低特异性 并且降 低产量。 bGC% 40%-60% C5端和中间序列要多 GC以增加稳定性 d避免3端GC rich,最后3个BASE不要有GC或者最后5个有3个不要是GC 避免3端的互补，否则容易造成 DIMER 避免3端的错配 避免内部形成二级结构 附加序列（RT site, Promoter sequenee）加到5端，在算Tm值时不需要加上这些序列 但在检 测互补和二级结构是要加上它们 需要使用兼并引物时，要参考密码子使用表，注意生物的偏好性，不要在3端使用兼并引物， 并使用较高的引物浓度（1uM-3uM） 最好学会使用一种 design software. PP5,Oligo6，DNAstar，Vector NTI，Online desgin et al. *引物的另一个重要参数是熔解温度 （Tm）。这是当50%的引物和互补序列表现为双链 DNA 分子时的温度.Tm对于设定PCR退火温度是必需的。在理想状态下，退火温度足够低，以保 证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火温度从 55C至U 70C。退火温度一般设定比引物的 Tm低5C。 设定Tm有几种公式。有的是来源于高盐溶液中的杂交，适用于小于 18碱基的引物。有的 是根据GC含量估算Tm。确定引物Tm最可信的方法是近邻分析法。 这种方法从序列一级结 构和相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。大部分计算机程序使用近邻分析法。 根据所使用的公式及引物序列的不同， Tm会差异很大。因为大部分公式提供一个估算的 Tm 值，所有退火温度只是一个起始点。可以通过分析几个逐步提高退火温度的反应以提高特异 性。开始低于估算的 Tm5C，以2 C为增量，逐步提高退火温度。较高的退火温度会减少引 物二聚体和非特异性产物的形成。 为获得最佳结果，两个引物应具有近似的 Tm值。引物对的Tm差异如果超过5C,就会引 物在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。如果两个引物 Tm不同，将退火 温度设定为比最低的 Tm低5C或者为了提高特异性，可以在根据较高 Tm设计的退火温度 先进行5个循环，然后在根据较低 Tm设计的退火温度进行剩余的循环。这使得在较为严紧 的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。 stability of primers 定制引物的标准纯度对于大多数 PCR应用是足够的。引物产量受合成化学的效率及纯化方 法的影响。定制引物以干粉形式运输。 最好在TE重溶引物，使其最终浓度为 100讪。TE比 去离子水好，因为水的pH经常偏酸，会引起寡核苷的水解。引物的稳定性依赖于储存条件。 应将干粉和溶解的引物储存在 -20C。以大于10卩M浓度溶于TE的引物在-20C可以稳定保 存6个月，但在室温（15C到30C）仅能保存不到1周。干粉引物可以在-20C保存至少1 年，在室温（15C到30C）最多可以保存 2个月。 3.optimize reacta nts concen trati on magn esiom ions Mg离子的作用主要是 dNTP-Mg与核酸骨架相互作用，并能影响 Polymerase的活性。一般 的情况下 Mg的浓度在之间调整。同样要记住的是在调整了 dNTPs的浓度后要相应的调整 Mg离子的浓度。对实时定量 PCR使用3-5mM带有荧光探针的镁离子溶液。 其他的离子 NH4+ K+都会影响PCF。增加K+的浓度后，会因为中和了核酸骨架上磷酸基团的负电荷而影 响退火的温度，从而降低了 PCR的严谨性（stringency）.NH4+也有相同的作用.MBI公司的TAQ 酶就提供了两种 BUFFER,一种是加Mg的一种是已经混合了 （NH4）2SO4的.当然，过高的阳离 子浓度（KCL时,DNA在94度根本不会发生变性，当然也就无从谈起 PCR了 . polymerase 不同公司的酶效有所不同，需要operator自己掌握适合的酶的浓度。一些高保真酶的效率要 远远低于 Taq polymerase,所以可能需要的酶的量也要大一些 .另外，一般的 情况下，变性 的温度可以使用 90~92度，变性的时间也可以缩短，从而保证polymerase的活性 template 50ul PCR SYSTEM human gDNA 10 ng-100 ng Lamada DNA Plasmid DNA temperature den aturati on 常规是94度5分钟，GC Rich的摸板是95度5分钟，除了 GC