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T SPOT TB技术用于辅助诊断结核临床病例报道 莫凌，孟成艳，张舒，金嘉琳，张文宏 作者单位: 200040上海，复旦大学附属华山医院感染科 通讯作者: 张文宏， Email: zhangwenhong@fudan.edu.cn 退修稿： 0074 基金项目: 国家重点基础研究发展计划（ 2005CB523102 ） 近年来，我国结核病的发病率有上升趋势， 临床上经常会遇到一些症状不典型的结核病 和肺外结核病，而目前可用于诊断结核病的方法有限，同时又缺乏快速敏感的实验室技术， 为结核病的早期诊断与治疗带来困难。 ELISPOT （ en zyme-li nked immu no spot assay,酶联免 疫斑点法）技术是一种新型的免疫酶技术， 它是从单细胞水平检测分泌抗体细胞或分泌细胞 因子细胞［1］。由ELISPOT发展来的T SPOT TB （结核感染T细胞斑点试验）技术就是通过 检测结核感染后T淋巴细胞分泌的特异性的细胞因子 IFN- y来诊断是否存在结核感染。 ELISPOT技术原理 该方法源于Mahairas等在1996年发现的一段存在结核分枝杆菌中名为“ RD1 ”的基因 序列［2］，而在卡介苗菌株和大部分环境中的分枝杆菌基因中则缺乏 RD1序列。RD1编码产 生两种蛋白：ESAT-6 和 CFP-10 （culture filtrate protein ）, ESAT-6 和 CFP-10 作为特异性抗原 刺激机体T淋巴细胞产生特异性的细胞因子 IFN- 丫。 根据这一原理，T SPOT技术利用结核杆菌感染者外周血单核细胞中存在结核特异的活 化T淋巴细胞，这些淋巴细胞在受到结核杆菌特异抗原刺激后分泌丫干扰素而设计的 T细 胞免疫斑点试验。外周血单核细胞，结核特异的混合抗原 A和混合抗原B （分别为ESAT-6 和CFP-10的部分多肽片断），对照试剂一起加入预先包被抗丫干扰素抗体的微孔培养板进 行培养。当外周血单核细胞中存在针对结核杆菌的效应 T淋巴细胞时，培养液中加入的结 核杆菌特异混合抗原多肽 A和B将刺激这些效应T淋巴细胞分泌丫干扰素。分泌的丫干扰 素被微孔板上的抗体捕获， 再次加入的碱性磷酸酶标记并针对丫干扰素不同表位的抗体与被 捕获的丫干扰素结合， 滞留在微孔板表面。显色底物溶液在反应部位被酶分解形成不溶性色 素沉淀斑点。每一个斑点代表一个丫干扰素分泌细胞（结核特异的效应 T细胞）。通过对斑 点进行计数可以推测体内是否存在对结核杆菌反应的效应 T细胞，从而对结核杆菌感染进 行辅助诊断。 ELISPOT操作方法 采集 8ml 患者的血液加入含柠檬酸钠的 CPT 采血管，分离外周血单个核细胞 （PBMC ）， 加入细胞培养液，轻轻重悬细胞。在已包被抗 IFN- 丫抗体的微量板的 4个孔中，分别加入 细胞培养液作为阴性对照，植物血凝素 PHA 作为阳性对照，结核分枝杆菌特异混合多肽 A 和 B，分别含 ESAT-6 与 CFP-10（ Oxford Immunote Ltd., Oxford, UK ）。然后在每个孔中加入 含250000个细胞的上述悬液。把微量板放在 37C培养16-20小时后，用PBS液洗板4次， 加入碱性磷酸酶标记的小鼠抗人 IFN- y单抗，在2-8 C下孵育1小时。孵育后再用 PBS液 洗板 4 次。最后每孔加入显色底物液 BCIP/NBTPLUS ，室温中静置 7 分钟后观察结果，并 用计算机辅助成像分析系统进行斑点阅读与统计（ ELISPOT 试剂盒由上海复星科技有限公 司提供）。第一孔为阴性对照孔，第二孔为阳性对照孔，如出现斑点，说明试验成功。第三， 四孔为实验孔， 当测试孔 A 或 B 达到以下标准则判定为阳性结果： （ 1 ） 如果阴性对照孔斑 点数为0-5个，测试孔斑点数减去阴性对照孔斑点数》 6。（2）如果阴性对照孔斑点数》 6 个，测试孔斑点数必须》 2倍的阴性对照孔斑点数。 3．ELISPOT 的临床应用 我院传染科首次将 T SPOT TB 技术用于临床，辅助诊断疑似结核患者，为结核病的诊 断提供了一项新的技术，并取得一定成效。现将一例经 T SPOT TB 技术鉴别诊断后得到有 效治疗反应的病例报道如下。 3． 1 ．病例报道 患者，男， 62 岁。入院前 3 月无诱因下出现颈部疼痛 ,一月前出现左上肢麻木 ,进行性乏 力，伴发热，体温在 38 度左右，无畏寒，寒战，无咳嗽，咳痰，无消瘦，盗汗等。入院查 体，精神较萎，左侧颈部可扪及肿大淋巴结，质软，无压痛。心肺无特殊，腹软，肝脾肋下 未及。颈软，克氏征（ -），布氏征（ -），余病理征均阴性。左上肢肌力 3级，肌张力可，余 肢体肌力，肌张力正常。 辅助检查，血常规：白细胞 9.42 X 109/L