GBT 15805.1--- 淡水鱼类检疫方法 第一部分.pdfVIP

中华人民共和国国家标准 Gs/T 15805.1一1995 淡水鱼类检疫方法 第一部分 The quarantine methods of freshwater fish-Part 1主题内容与适用范围 本标准规定了淡水鱼类传染性胰坏死病((IPN)、传染性造血器官坏死病(IHN )、病毒性出血性败血 症(VHS)、斑点叉尾鲍病毒病((CCVD)、鲤春病毒病((SVC),疖疮病、弧菌病和昏眩病的检疫方法。 本标准适用于口岸进口国外淡水鱼类的检疫，也适用于我国国内地区间同种疾病的检疫。 2设备和器械 检疫中所用设备和器械除根据各个学科有特殊要求外，均指鱼病实验室常用的设备和器械。 3传染性胰坏死病(Infectious Pancreatic Necrosis，简称IPN) 该病病原属双链RNA病毒。 本病流行于美洲、欧洲和亚洲。 最新文献资料 主要感染对象是鱼龄6个月以内的虹缚、美洲红点蛙等蛙缚鱼类。6个月以上的鱼可以是无症状的 带病毒鱼，鱼卵也可携带病毒。 3.1临床检查 3.1.1活动情况 病鱼游动失调，常作垂直回转游动，不久便沉人底部死亡。从开始回转游动到死亡的时间为1-2h。 在有水流的饲养池中可见失去游泳能力的鱼随水流贴在排水口的拦网上。 3.1.2外部检查 病鱼体色暗黑，眼球突出，腹部膨胀。腹壁和鳍基部有出血现象。病鱼多从肛门排出线状粘液样粪 便。 3.1.3剖检 除幽门垂出血外，肝脏和脾脏显著褪色，通常消化道内无食物，胃和肠前部积有乳白色粘液而肿胀。 3.2实验室检验 3.2.1病毒分离 3.2.1.1细胞准备 a 设备及器械 无菌室、超净工作台、恒温培养箱、低温冰箱(一30 0C )、液氮罐、赛氏漏斗和。3,0.45 fm混合纤维 素酷微孔滤膜、细胞培养瓶、白色橡皮塞等。 b 培养基及试剂 细胞生长液、胰酶-EDTA(乙二胺四乙酸)混合消化液、小牛血清,L一谷氨酞胺、碳酸氢钠、酒精。 细胞生长液等配制方法见附录A(补充件)。 c.接种前的细胞准备 国家技术监!局1995一12一08批准 1996一07一01实施 GB/T 15805. 1一1995 传染性胰坏死病毒用CHSE-214,RTG-2细胞分离。CHSE-214, RTG-2最适培养温度分别为21,C 和20 C。选择生长良好，形成单层的细胞培养物，倒去生长液加人适量胰酶-EDTA混合消化液消化，然 后补加生长液，按1:2或1:3的分种率将原瓶消化的细胞分装入2个或3个培养瓶中，置适温中继续 培养，当单层致密度达80%左右，即可用于病毒接种。 3.2.1-2 样品接种 a. 设备及器械 同3.2.1.1条a的规定，另增加冷冻离心机和1,2 mL规格的移液管。 b 常用的溶液 细胞维持液、磷酸缓冲盐水 〔配制方法见附录A(补充件)」。 c. 取样 有症状的鱼，取10尾以上样品作病毒分离用。 无症状的鱼，取60尾以上样品作病毒分离用。 对鱼卵，取60^-100粒样品作病毒分离用。 对于少量进出口成鱼，从尾动脉抽1-2 mL血液，其血浆作病毒分离用，血清作抗体检测。 d.样品处理 较大的鱼取其肾、肝、脾。仔、稚鱼取鱼体全部，若是带卵黄囊的鱼应去掉卵黄囊。鱼卵则取全卵。 将上述待检样品称重，加磷酸缓冲盐水((PBS)匀浆，并稀释成10-，离心30 min(4 000 r/min)，弃 去沉淀物，将上清液通过。.45 Wm微孔滤膜除菌，然后再用PBS进行10倍稀释，即成样品。 血液样品置于常温下1h后，再放在4℃下12h以上，以析出血清。然后低速离心，其沉淀作待检样 品，按上述方法制备样品液，血清作中和试验。最新文献资料 e.接种细胞 倒出细胞瓶中的培养液，然后接种样品液，接种量为维持液的10-,吸附1h后，加细胞维持液培 养，同时设对照。 3.2.1.3病毒培养 传染性胰坏死病病毒(IPN V)培养温度是15-20C。在培养过程中每日观察细胞变化情况，观察 7