染色体显带原理与技术[宣讲].ppt

实验方法 将标本置于pH6.0缓冲液中浸5～10分钟 后，再转浸入用Soresens缓冲液(pH6.0)配制 的0.2%的喹吖因、阿的平染液中染色5～10 分钟，用pH6.0的磷酸缓冲液漂洗2次，每次 5分钟，于玻片上滴加1～2滴新鲜缓冲液，加盖片，在荧光显微镜下观察。 * 精品PPT | 借鉴参考 Caspersson等（1971）的方法： 取用空气干燥标本的玻片→浸入95%、70%、50%的乙醇和蒸馏水使其吸水→浸入pH7的柠檬酸/磷酸盐缓冲液中→用预温至20℃芥子喹吖因（50ug/ml）染液染色20分钟 →在上述缓冲液中漂洗三次，每次5分种→然后用缓冲液盖片封存→在荧光显微镜下观察。 * 精品PPT | 借鉴参考 显带观察 带型与G显带标本一致，荧光显微镜下观察染色体上呈现出的亮带就相当于G显带染色体标本的深带。 1号染色体： 短臂由远端的弱荧光节段逐渐过渡到一中等荧光节端，后者可分为两条带。长臂有5条中等荧光带，中央一条最明显，次缢痕的荧光阴性。 * 精品PPT | 借鉴参考 * 精品PPT | 借鉴参考 Ｎ显带 此技术可以使13、14、15、21和22号 染色体的随体和随体柄着色。 * 精品PPT | 借鉴参考 实验原理 人类的近端着丝粒染色体(即13、14、 15、21和22号染色体)的副缢痕处与核仁形成有关，故称核仁形成区（nucleolus-organizing region，NOR），它是中期染色体上的明显结构之一。应用DNA-RNA分子杂交技术,证明人类的18S和28S核糖体RNA (rRNA编码结构)的基因(rDNA)位于NOR。目前已有多种技术可以显示中期染色体上的核仁形成区。 * 精品PPT | 借鉴参考 其中最简单而又准确的方法是银染法,即利用硝酸银将具有转录活性的核仁形成区(rRNA基因)特异性地染成黑色,人们将这种银染阳性的核仁形成区称为Ag-NOR,它们是具有转录 活性的18SrRNA基因和28SrRNA基因所在的部位。 由于具有转录活性的rRNA基因(rDNA)往往伴有丰富的酸性蛋白质,该类蛋白质含有巯基（-SH）和二硫键（-S-S-）,能使AgNO3中的Ag+还原成Ag颗粒,因此有转录活性的核仁形成区常被镀上银颗粒而呈现黑色,没有转录活性的NOR则不着色。故其着色程度与细胞中rRNA基因的转录活性相一致。在同一物种，Ag-NOR的数目以及它们在染色体上的位置是相对恒定的，如果发生了改变就意味着rRNA基因的活性发生了变化，故此项技术是目前探讨rRNA基因功能的方法之一 * 精品PPT | 借鉴参考 此外，人类近端着丝粒染色体的随体间易发生联合，这种联合可能是造成近端着丝粒染色体不分离、断裂和易位的原因。利用银染技术可在发生联合的染色体间清楚地看 到有银染物质相连。因此，银染近端着丝染色体联合（Ag-stained acrocentric association ,Ag-AA）可以作为准确地判断人体细胞是否存在近端着丝粒染色体随体联合的客观标准。 目前，也将Ag-AA看作反映rRNA基因活性大小的一个指标。所以银染技术已逐渐受到重视，并已开始广泛应用于肿瘤细胞遗传学、体细胞遗传学、进化遗传学、临床细胞遗传学及药物、化学因素等的遗传效应的研究上。 * 精品PPT | 借鉴参考 实验用品 光学显微镜、恒温水浴箱、移液枪、培养皿（ 干燥）、吸管、擦镜纸、小镊子、未染色的染 色体标本片（片龄一周以内）、硝酸银、甲 酸、Giemsa染液、一次性离心管（15ml）、 去离子水、锡箔纸等。 * 精品PPT | 借鉴参考 实验方法 1、设一60℃水浴箱；另置Giemsa染液缸于37℃水浴箱。 2、临时配制新鲜的AgNO3溶液：取一次性离心管（15ml）一支，称取AgNO3 5g溶于10ml去离子水中，加10ul甲酸，混匀。将一干燥培养皿漂于60℃水浴箱水面上。 3、将玻片用4层干净擦镜纸（略小于玻片大小）盖好。 4、用吸管将AgNO3溶液慢慢滴于玻片纸上，直至擦镜纸呈棕黄色（黑色）为止，一般5ml能滴两张玻片。 5、擦镜纸变黑后，用镊子轻轻启开擦镜纸，（将玻片）用自来水冲干净。 * 精品PPT | 借鉴参考 6、Giemsa染色：吉姆萨母液用蒸馏水按一定的比例稀释。例如，10份蒸馏水加1份吉姆萨母液稀释即为10：1。一般染色5分钟。 7、染色后的玻片标本用自来水洗去多余染料，染色过深可用磷酸缓冲液脱色。室温下风干后即可镜检，必要时可用树胶封片。镜检时先在低倍镜下选择分散好、长度适中的分裂相，然后转换油镜观察其显带的情况